納米氧化銅對人肝癌細胞的毒性作用

張金波 呂冬霞 鐘健 盧春鳳

(佳木斯大學 1基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2 2017級臨床7班)

納米氧化銅具有熱穩定性、催化性能和一定的抗菌效應，因此可用于抗菌材料、生物醫學陶瓷材料、光學電子、催化劑、廢水處理等行業中〔1～5〕。由于眾多的納米氧化銅產品開發和利用，它已不可控地分布于空氣、水、土壤中，生物體會通過皮膚、呼吸道等多種途徑攝入，因此，納米氧化銅是否會給生物體帶來影響已成為生物醫學領域研究的熱點問題。肝臟作為消化系統的重要器官，具有清除體內外毒性物質、保護機體免受毒素侵襲的作用。肝臟、脾臟、腎臟等臟器是納米顆粒蓄積的部位，因此，納米氧化銅蓄積可能對肝臟造成一定的影響。人肝癌HepG2細胞分化程度較高，具有較完整的代謝系統，可作為評價化學危險性的理想體外模型〔6〕。因此，本研究以HepG2細胞為細胞模型，通過對細胞增殖活性和乳酸脫氫酶(LDH)的檢測探索納米氧化銅的毒性作用，為納米氧化銅的安全性評估和合理地應用提供相關依據。

1 材料和方法

1.1材料 HepG2細胞:購自中國科學院上海生命科學研究院。二氧化碳細胞培養箱:上海易亮醫療器械有限公司，激光共聚焦顯微鏡:日本Olympus公司，全自動多功能酶標儀:美國Bio Tek公司。納米氧化銅顆粒:球狀，直徑40 nm，杭州萬景新材料有限公司。二甲基亞砜(DMSO):美國Sigma公司，改良型杜氏伊格爾培養基(DMEM)、胎牛血清:美國Gibco公司，LDH試劑盒：南京建成生物有限公司，胰蛋白酶、CCK-8試劑盒:上海碧云天生物技術有限公司。納米氧化銅顆粒懸液的配制：用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解1 mg納米氧化銅顆粒粉末，超聲振蕩至完全溶解，高壓蒸汽滅菌后密封，4℃冷藏；用無血清培養基稀釋成需要的濃度待用。

1.2細胞培養與染毒 將細胞懸液加入到6孔板，每孔加入2 ml，接種密度是1×105/ml，培養24 h后把培養液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml的納米氧化銅顆粒處理細胞，二氧化碳細胞培養箱培養24 h。

1.3形態學改變 將細胞懸液以1×105/ml加入到6孔板中，培養24 h后把培養液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞，24 h 后，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.4Hoechst33258細胞核染色 將細胞懸液以1×105/ml加入到6孔板中，培養24 h后把培養液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞，培養24 h后把培養液棄去，PBS 液沖洗，用4%甲醛室溫下固定15 min，PBS沖洗，染色液染色15 min，PBS沖洗，運用激光共聚焦顯微鏡顯示細胞核形態變化。

1.5細胞活性的CCK-8法測定 將細胞懸液以8×104/ml加入96孔板，培養24 h后把培養液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞，培養24 h后加入CCK-8 10 μl，培養2 h后使用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。每組設定4個復孔。

1.6細胞膜完整性的測定 將細胞懸液以8×104/ml加入96孔板，培養24 h后把培養液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞24 h，按照試劑盒說明書對細胞上清液中LDH活力進行檢測。每組設6個復孔。

1.7統計學方法 運用SPSS17.0 軟件，多組間比較采用單因素方差分析和方差齊性檢驗。進一步進行組間兩兩比較，若方差齊時，采用SNK檢驗；若方差不齊，采用Games-Howell 檢驗；率的比較采用χ2檢驗。兩組比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1細胞形態學變化 對照組細胞呈正常的梭形，細胞貼壁生長，外形規則，輪廓清晰；染毒濃度是25 μg/ml時，細胞形態變得不規則，開始變圓；染毒濃度達50 μg/ml時，細胞變形明顯，變小變圓，輪廓不清楚，細胞間隙增大；染毒濃度達到100 μg/ml時，細胞變成圓形，胞質不通透，細胞生長狀態差，不能牢固貼壁，部分細胞漂浮在細胞液中，可見細胞碎片。見圖1。

圖1 不同濃度納米氧化銅染毒后HepG2細胞的形態變化(×200)

2.2細胞核染色 對照組細胞核呈長圓形，外形規則，輪廓清楚；染毒濃度是25 μg/ml時，部分細胞核可見染色質呈凝集狀態，染毒濃度達50、100 μg/ml時，細胞核縮小，染色質凝集程度變高，發生凋亡改變。見圖2。

2.3細胞活性的檢測結果 25、50、100、200 μg/ml的納米氧化銅處理細胞后，細胞存活率分別為(88.30±5.58)%，(85.68±3.91)%，(64.93±2.95)%，(47.73±1.98)%，對照組(0 μg/ml組)細胞存活率為100%。不同濃度納米氧化銅染毒組HepG2細胞的存活率與對照組相比均明顯降低(P<0.05)；細胞存活率隨著納米氧化銅染毒濃度的上升呈下降趨勢。

圖2 不同濃度納米氧化銅染毒后細胞核形態變化(Hoechst33258染色，×10)

2.4細胞膜完整性的測定結果 0、25、50、100 μg/ml納米氧化銅處理細胞后，細胞上清液中LDH活力分別為(667.83±6.06)、(824.28±27.30)、(1 315.62±23.04)、(1 792.30±10.20)μg/ml。25、50、100 μg/ml納米氧化銅組HepG2細胞LDH的活力與對照組(0 μg/ml組)相比均升高(P<0.01)；細胞中LDH活力隨著納米氧化銅染毒濃度升高呈上升趨勢。

3 討 論

當化合物或顆粒在三維空間的尺寸至少有一個維度在1～100 nm就稱納米粒子〔7〕。由于其具有特殊的理化性質〔8〕，現已用于生物醫藥、機械環保、電子、化妝品等領域〔9〕。納米氧化銅具有良好的分散性、熱穩定性、抑菌性能、催化特性等特點，被用于半導體、抗菌制劑和催化劑等領域〔10〕。已有研究表明，納米氧化銅能夠對機體產生毒性效應〔11〕。所以，研究納米氧化銅對生物體的毒性效應更加重要，豐富納米材料毒性的理論數據，可為其科學、合理的應用和安全處理提供理論論據〔12〕。

納米粒子具有特殊的理化性能，使其更容易通過細胞膜而進入細胞〔13,14〕，引起細胞形態發生一定變化。Gong等〔15〕認為納米粒子會對細胞膜造成一定損害，使細胞皺縮，無法牢固貼壁。李娜〔16〕發現納米氧化銅處理 A549細胞后，細胞發生明顯的形變，納米氧化銅可分布于細胞質、溶酶體、線粒體及細胞核等細胞器中。Wang 等〔17〕研究表明，納米氧化銅能夠到達溶酶體膜，對其破壞。本實驗結果也表明納米氧化銅達到一定濃度對細胞具有一定的毒性。隨著納米氧化銅染毒濃度增加，可見凋亡的特征性改變，如染色質高度凝集、核固縮等。

研究顯示〔18,19〕，納米氧化銅會影響細胞增殖活性，使細胞產生過多的氧自由基(ROS)，啟動細胞凋亡。本研究證實，納米氧化銅染毒組細胞存活率明顯降低，且隨著納米氧化銅染毒濃度的上升呈下降趨勢。Maqsood等〔20〕用22 nm的氧化銅作用于HepG2細胞，細胞存活率也會下降，且與納米氧化銅濃度呈正比，與本實驗結果相符。

LDH存在于活細胞胞質中，能夠把乳酸催化成丙酮酸。正常細胞會將少量LDH釋放到細胞外，如果細胞膜遭到破壞，LDH會大量釋放到細胞外液中，所以細胞膜是否受損可以通過細胞外液中LDH的活力來判斷。實驗證明，納米氧化銅染毒組LDH的活力明顯升高，且隨著納米氧化銅染毒濃度升高呈上升趨勢。說明納米氧化銅顆粒能使細胞膜發生損傷，使細胞的增殖受到抑制引起死亡。Akhtar等〔21〕研究發現，5～15 μg/ml納米氧化銅顆粒作用于小鼠胚胎成纖維細胞BALB 3T3，LDH活性顯著增高，表明納米顆粒能損害細胞膜，對細胞具有劑量相關性毒性效應，與本研究結果相符。

綜上所述，40 nm氧化銅顆粒能抑制HepG2細胞增殖,使細胞形態發生改變，細胞膜發生損傷，對細胞產生毒性效應。