川芎嗪對人肝癌細胞鈣激活中性蛋白酶-2、黏著斑激酶及遷移侵襲能力的影響

王寧 劉振華 王飛清 李克躍 潘婭

(1貴州省骨科醫院藥劑科，貴州 貴陽 550004；2貴州大學附屬人民醫院肝膽外科;3貴州中醫藥大學附屬第一醫院檢驗科；4貴州醫科大學生理教研室)

不同轉移能力肝癌細胞系中鈣激活中性蛋白酶(Calpain)-2表達具有差異，與肝癌細胞的侵襲遷移能力呈正相關〔1～4〕；黏著斑激酶(FAK)在細胞增殖、存活、遷移和侵襲等諸多細胞事件中發揮重要作用〔5，6〕，FAK表達和活性升高與肝細胞癌(HCC)轉移及預后不良關系密切〔7〕。川芎嗪(TMP)具有鈣離子拮抗作用〔8，9〕，然而在肝癌細胞中的作用機制仍未徹底闡明，本文就TMP對人肝癌細胞Calpain-2、FAK及遷移侵襲能力的影響進行研究，以了解其抑制肝癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 MHCC97-H肝癌細胞系由中國科學院上海生命科學院細胞庫提供，鹽酸TMP注射液(北京四環科寶制藥有限公司，批號14032015)用DMEM培養液溶解為1.0 mg/ml質量濃度〔10〕，使用0.22 μm直徑的濾器進行除菌過濾備用。兔抗FAK(Y570)抗體：美國Bioworld Technology公司，羊抗Calpain-2(C-19)抗體購于Santa Cruz公司。

1.2MHCC97-H細胞培養 采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養基(高糖)進行細胞培養；置于 37℃含5%CO2的孵育箱中進行培養，每隔2 d更換培養基1次，待細胞生長融合達 80%左右進行后續的實驗處理。

1.3劃痕實驗 待MHCC97-H細胞生長至90%時，1×105個/ml/孔細胞接種于24孔板，待24 h后細胞融合85%，用20 μl加樣槍頭進行劃痕，減血清培養基饑餓處理4 h后加入TMP(1.0 mg/ml)培養細胞24 h。0 h、24 h測量劃痕寬度計算細胞遷移率。

1.4侵襲實驗 使用基質膠在Transwell小室上層鋪成單層，放入37℃細胞培養恒溫孵育箱中孵育40 min。消化貼壁細胞后制備細胞懸液，分為對照組和TMP組，其中TMP組細胞予以TMP處理24 h，其余條件相同，每個Transwell小室孔接種1×105個細胞，置于24孔板中并加含10%FBS 的DMEM培養基。棉簽擦去小室內層的基質膠，結晶紫染色，測穿越的細胞OD值及穿膜細胞數。

1.5Western印跡法檢測蛋白水平 兩組細胞培養24 h后棄陳舊的培養液，溫熱的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)清洗2遍。預冷的細胞裂解液充分裂解細胞，收集細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。在高速冷凍離心機中4℃，離心20 min，轉速14 000 r/min。二喹啉甲酸(BCA)方法進行樣品蛋白定量，1成濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)進行樣品濃度調整上樣，行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，濕轉法轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉進行封閉，一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育1.5 h，漂洗后采用化學發光法進行顯色，凝膠成像儀成像分析Calpain-2、FAK表達水平，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。

1.6統計處理 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1TMP對肝癌細胞MHCC97-H中Calpain-2、FAK蛋白表達量的影響 與對照組相比，TMP組Calpain-2、FAK蛋白表達量明顯下降(P<0.05)。見表1，圖1、2。

2.2TMP對肝癌細胞MHCC97-H遷移、侵襲能力的影響 與對照組比較，TMP組MHCC97-H細胞遷移率、穿膜細胞數〔(98±13)個vs(38±7)個〕及OD值明顯下降(P<0.05)。見表1、圖3、4。

表1 兩組侵襲能力、遷移率及Calpain-2、FAK蛋白表達比較

與對照組比較：1)P<0.05

圖1 Western印跡法檢測兩組Calpain-2蛋白表達量

圖2 Western印跡法檢測兩組FAK蛋白表達量

圖3 兩組培養不同時間細胞遷移率(×100)

圖4 兩組穿膜細胞數(×100)

3 討 論

近年來，原發性肝癌領域的研究進展非常迅速，對這類腫瘤的診斷和治療取得了很大的進步〔11～13〕。目前對于肝癌的有效治療包括肝部分切除、局部消融和肝移植，這使得5年生存率有了較大提高〔14～16〕。然而，肝移植受到供體器官短缺和器官可用性的限制，而手術切除后仍然存在術后復發率高，肝內轉移等風險〔17〕。因此，尋找新的更為有效的藥物及治療方法來對抗原發性肝癌的轉移，延長患者的生存是目前探索的重要方向之一。TMP是中藥川芎中提取出來的有效單體，臨床應用較為廣泛，作用機制較為復雜，研究發現，TMP能改善糖氧剝奪海馬神經元細胞內鈣超載，具有鈣拮抗作用，保護腦組織〔8〕。同樣，郭自強等〔9〕研究發現TMP對血管緊張素Ⅱ所介導引起細胞內鈣離子升高導致的心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞增殖具有抑制作用。Calpain參與細胞內多種反應，與細胞凋亡、增殖和蛋白質重整反應、細胞黏附、遷移有關，同時也是細胞遷移的一個重要信號轉導體。Calpain-1和Calpain-2是Calpain的兩個經典成員，不同濃度的鈣離子水平是激活他們的條件。研究發現Calpain-2可以作為抑制腫瘤侵襲轉移的一個潛在靶點〔18〕。FAK是一種重要的非受體蛋白酪氨酸激酶，在乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌和肝癌在內的多種人類腫瘤中過表達和(或)高度磷酸化〔19〕，提示該蛋白在腫瘤形成和惡性進展中可能具有潛在作用〔21〕。FAK的活性對許多與癌細胞生長和轉移相關的細胞增殖、遷移、侵襲、上皮-間質轉化及血管生成過程中起重要作用〔20〕。Miyasaka等〔22〕發現，與癌旁非癌組織樣本相比，原發性肝癌樣本中FAK基因表達上調。Chen等〔23〕發現FAK的多種形式在原發性肝癌組織中過度表達，并且與腫瘤分期、血管侵入和肝內轉移相關。 Calpain作用的底物較為廣泛，除與整合蛋白結合外，還能作用其他黏附性蛋白。研究發現，Calpain可能通過對FAK蛋白進行剪切影響FAK激酶活性，從而改變細胞局部的黏附能力，這可能是其調控細胞遷移的機制之一〔24〕。同時，瞬時的Ca離子濃度升高可以協助FAK的磷酸化而使其活化〔25〕。FAK在整合素介導的信號傳導過程中發揮中心分子作用，其活化后可通過調節一系列信號傳導通路而影響細胞增殖和存活。本實驗中，通過TMP處理后，MHCC97-H 中Calpain-2、FAK蛋白含量明顯下調，其遷移率、穿膜細胞數及OD值明顯下降，這可能與TMP發揮鈣拮抗作用，抑制Calpain-2、 FAK的表達從而使得肝癌細胞系的遷移侵襲能力減弱。