survivin對(duì)血小板源生長因子刺激的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

孟巖 劉宏偉 孫鵬

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

眼內(nèi)出血、孔源性視網(wǎng)膜脫離、眼球穿通傷和視網(wǎng)膜脫離復(fù)位手術(shù)以后，視網(wǎng)膜表面、玻璃體內(nèi)的細(xì)胞增生及收縮會(huì)引起牽引性的視網(wǎng)膜脫離，稱為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變，該病的發(fā)生與血小板源生長因子(PDGF)有關(guān)，其可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖，而視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞過度增殖是增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)生的重要原因之一，因此，研究抑制PDGF對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖誘導(dǎo)作用對(duì)于防治相關(guān)眼病的發(fā)生具有十分重要的意義〔1～3〕。survivin是一種與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)控基因，其是一種凋亡抑制因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，在生命體正常生理功能維持中具有重要作用〔4,5〕。研究表明，survivin反義核苷酸可以誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，并且在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡中表達(dá)下調(diào)〔6,7〕。本實(shí)驗(yàn)探討survivin在PDGF處理的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞hRPE購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；JC-1染液線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；cDNA合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher；引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成；survivin抗體購自美國Pllaboratories；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；PDGF購自美國R&D；siRNA control和survivin siRNA由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司合成；剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase-3)、細(xì)胞色素(Cyt)C抗體購自美國CTS。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞hRPE培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，用含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素。細(xì)胞分為：對(duì)照組、PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組。PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μg/L的PDGF，siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組細(xì)胞分別用轉(zhuǎn)染siRNA control和survivin siRNA后的hRPE細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的步驟同方法與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書相同。首先用qRT-PCR和Western印跡方法測定對(duì)照組、PDGF組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h以后，細(xì)胞中survivin mRNA和蛋白水平。再以qRT-PCR和Western印跡方法檢測PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中survivin mRNA和蛋白水平，步驟同1.3和1.4。

1.3qRT-PCR檢測人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中survivin水平 收集各組細(xì)胞，以每107個(gè)細(xì)胞中加入1 ml的Trizol把各組細(xì)胞裂解以后，在裂解液中添加200 μl的三氯甲烷，室溫劇烈震蕩15 s后，靜置10 min。轉(zhuǎn)移到4℃離心機(jī)，以10 000 r/min離心10 min。吸取最上層溶液同異丙醇充分混合以后，離心。將上清溶液吸除掉以后，添加75%的乙醇將RNA沉淀洗滌3次。將RNA置于室溫中，待乙醇全部揮發(fā)以后，以焦碳酸二乙酯(DEPC)處理后的水溶解。移液槍吸取約2 μl的RNA以紫外分光光度計(jì)檢測濃度和純度。取2 μg的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR，PCR為25 μl反應(yīng)體系，其中包括：cDNA 1 μl、1 μl的10 μmol/L引物、12.5 μl的2×SYBR Green混合物。PCR儀設(shè)置程序?yàn)椋?5℃ 30 s，(62℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán))。β-actin為內(nèi)參基因，引物為：β-actin-正義鏈5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反義鏈5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。survivin-正義鏈5′-GGAC-CACCGCATCTCTACAT-3′，反義鏈5′-GCAC-TTTGCCAGTTTCC-3′。

1.4Western印跡檢測人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中survivin水平 收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞中加入蛋白裂解液，以常規(guī)方法提取各組細(xì)胞蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。蛋白樣品在-80℃保存。每個(gè)泳道上樣40 μg，在上樣前將蛋白同上樣緩沖液煮沸變性后，加入到上樣孔內(nèi)，凝膠為：10%的分離膠、5%的濃縮膠。在濃縮膠中電泳電壓為80 V，在分離膠中電泳電壓為100 V。觀察溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠的底部邊緣以后，把電源關(guān)閉，終止電泳。取出凝膠，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到裁剪好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜置于冰上進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜的電壓調(diào)整為90 V。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的PVDF膜用5%牛血清白蛋白置于37℃中封閉2 h以后，再放入含有一抗(1∶400稀釋，4℃過夜)、二抗(1∶2 000稀釋，37℃孵育2 h)的孵育袋中充分結(jié)合，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法化學(xué)放光以后，用Bio-Rad采集各組圖像，用Quantity One分析條帶的灰度值，β-actin作為內(nèi)參，用各目的條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)檢測人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖情況 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞種植到96孔板內(nèi)，按照對(duì)照組、PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組方法分組處理，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，在每個(gè)培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入MTT溶液，孵育4 h以后，把上清溶液吸棄掉，添加二甲基亞砜(DMSO)，待結(jié)晶物溶解掉以后，將96孔板置于酶標(biāo)儀上，調(diào)整波長為492 nm，測定OD值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡情況 各組按照上述方法孵育48 h以后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)把各組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞洗滌2次，在細(xì)胞中加入400 μl的結(jié)合緩沖液，再分別加入5 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)，于室溫中孵育15 min以后，在60 min內(nèi)以流式細(xì)胞儀檢測。各組按照上述方法孵育48 h以后，提取細(xì)胞總蛋白，用Western印跡方法測定細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase-3蛋白水平，步驟同1.4。

1.7JC-1法檢測線粒體膜電位 各組按照上述方法孵育48 h以后，收集細(xì)胞，在細(xì)胞中加入JC-1染液，置于37℃孵育30 min，以流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越高，線粒體膜電位越高。

1.8Western印跡檢測胞質(zhì)中CytC蛋白水平 各組按照上述方法孵育48 h以后，用胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取胞質(zhì)中的蛋白，以Western印跡方法測定CytC蛋白水平。步驟同1.4。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PDGF處理后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中survivin表達(dá)水平 PDGF組survivin mRNA和survivin 蛋白水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡測定survivin蛋白表達(dá)

組別survivin mRNAsurvivin 蛋白對(duì)照組1.00±0.000.14±0.04PDGF組3.62±0.250.46±0.03t/P值18.152/0.00011.085/0.000

2.2各組細(xì)胞中survivin表達(dá)水平 survivin siRNA+PDGF組survivin mRNA和蛋白水平顯著低于PDGF組(P<0.05)。siRNA control+PDGF組survivin mRNA和蛋白水平與PDGF組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表2。

1～3：PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組圖2 Western印跡測定survivin蛋白表達(dá)

組別survivin mRNAsurvivin 蛋白PDGF組1.00±0.000.51±0.06siRNA control+PDGF組1.01±0.130.50±0.08survivin siRNA+PDGF組0.23±0.041)0.17±0.051)F/P值97.411/0.00026.952/0.001

與PDGF組比較：1)P<0.05

2.3各組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖能力比較 PDGF組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞OD值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞OD值顯著低于PDGF組(P<0.05)。siRNA control+PDGF組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞OD值與PDGF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4各組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡率比較 PDGF組細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF組細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平顯著高于PDGF組(P<0.05)。siRNA control+PDGF組細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平與PDGF組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表4。

2.5各組線粒體膜電位及CytC水平比較 PDGF組線粒體膜電位顯著升高，CytC水平顯著降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF組線粒體膜電位顯著降低，CytC水平顯著升高，與PDGF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA control+PDGF組線粒體膜電位及CytC蛋白水平與PDGF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、表5。

表3 各組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞OD值比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與PDGF組比較：2)P<0.05；表4、5同

1～4:對(duì)照組;PDGF組;siRNA control+PDGF組;survivin siRNA+PDGF組；圖5同圖3 Western印跡檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平

圖4 各組流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

表4 各組細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平比較

圖5 Western印跡檢測細(xì)胞質(zhì)中CytC蛋白水平

組別線粒體膜電位(熒光值)CytC對(duì)照組645.26±34.230.38±0.04PDGF組892.45±31.301)0.14±0.031)siRNA control+PDGF組897.62±21.930.15±0.04survivin siRNA+PDGF組715.46±26.282)0.26±0.042)F/P值58.457/0.00026.579/0.000

3 討 論

PDGF能夠刺激膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞增生，是一種較強(qiáng)的分裂誘導(dǎo)劑，在單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等中存在，不僅參與組織的生長和發(fā)育，還與創(chuàng)傷的愈合、腫瘤等有關(guān)〔8～12〕。研究表明，PDGF參與眼科疾病的發(fā)生，其可以誘導(dǎo)角膜成纖維細(xì)胞增殖、抑制晶狀體上皮細(xì)胞生長，可以在體外誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生〔13～15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDGF刺激后的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖能力升高，說明PDGF誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生，與上述研究報(bào)道結(jié)果一致。

survivin基因位于染色體17q25上，其編碼的蛋白質(zhì)含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列，在這個(gè)序列中包括一個(gè)Cys-Pro-Thr片段，這個(gè)片段將該序列分成兩個(gè)部分，在survivin的羧基端有一個(gè)α-螺旋motif，參與微管結(jié)合過程，這些功能結(jié)構(gòu)域與survivin蛋白的功能密切相關(guān)〔16〕。survivin與細(xì)胞的生長和凋亡有關(guān)，其可以通過Caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔17〕。在心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、關(guān)節(jié)炎細(xì)胞等多種細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)survivin參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡〔18〕。survivin在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變中表達(dá)陽性，參與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖，下調(diào)其表達(dá)后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDGF刺激后的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中survivin水平升高，提示survivin可能參與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)還通過siRNA技術(shù)下調(diào)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中survivin表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，survivin沉默后的細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高，同時(shí)線粒體膜電位下降，細(xì)胞質(zhì)中CytC蛋白水平升高，說明下調(diào)survivin可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)PDGF條件下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生與細(xì)胞凋亡異常減少有關(guān)，其在PDGF處理后，細(xì)胞的增殖速度加快，凋亡減少〔20〕。研究顯示，survivin不僅參與細(xì)胞生長過程，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)，沉默其表達(dá)后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)Caspase蛋白家族有關(guān)〔21,22〕。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡發(fā)生的原因之一，正常情況下，線粒體膜電位在線粒體內(nèi)外物質(zhì)交換、滲透壓維持中具有重要作用，而在細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體膜電位下降，使得線粒體內(nèi)的CytC釋放至胞質(zhì)中，而CytC可以激活胞質(zhì)中的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔23～25〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默survivin可以促進(jìn)PDGF條件下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，并且其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制與線粒體途徑有關(guān)。

綜上，PDGF誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞中survivin表達(dá)，沉默其表達(dá)后可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，抑制細(xì)胞的增殖，這為以后研究增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變過程中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于明確增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)生機(jī)制具有重要意義。