勿動蛋白-A在慢性前腦缺血致血管性癡呆大鼠中的表達及意義

云中芹 劉淑清 朱正禹 程寶艷

(山東大學第二醫院 1招遠分院(玲瓏英誠醫院)神經內科，山東 招遠 265400；2神經內科)

慢性腦缺血為多種因素作用于腦組織，引起腦供血不足、缺血缺氧，腦細胞代謝、功能障礙的一系列病理生理過程〔1,2〕。通過永久性結扎大鼠雙側頸總動脈，使其腦組織慢性缺氧、缺血，腦組織正常功能受損，這與血管性癡呆的發病過程相近。相關研究顯示〔3〕，腦組織長期缺血可引起大腦皮層神經元壞死、梗死灶形成。神經細胞的再生受到多種因素的影響，如神經影響因子、抑制性蛋白等，而勿動蛋白(Nogo)-A是對神經修復較為不利的一種細胞因子〔4〕。Nogo-A廣泛存在于中樞神經元、少突膠質細胞中。本研究探討Nogo-A在慢性前腦缺血致血管性癡呆大鼠中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1試劑 多克隆兔抗鼠Nogo-A 抗體(BDBiosciences 公司)；Nogo-A檢測試劑盒，上海江萊生物公司；Morris水迷宮、低溫高速離心機，中國醫學科學院藥物研究所提供。

1.2分組 64只Wistar大鼠，體重280～320 g，由山東大學動物中心專門購買飼養。在整個實驗過程中，嚴格遵循山東大學基礎實驗中心的相關準則和管理規范。

1.3建立血管性癡呆模型 隨機選擇32只大鼠造模，納入癡呆組。大鼠禁食6 h，10%水合氯醛(1.25 ml/100 g)麻醉。頸前部去毛，仰臥手術臺，頸部正中做1 cm切口，對切口進行鈍性分離，結扎雙側頸總動脈。其余32只大鼠納入對照組，除不結扎血管外，其余操作相同。操作完成后，縫合皮膚送至飼養房，室溫保持20℃。造模后第5天行Morris水迷宮試驗，每次2 min，每日5次。第3日記錄成績，若逃避潛伏期大于20 s或兩次進入其他盲端則為血管性癡呆模型成功〔5〕。

1.4水迷宮試驗 Morris水迷宮由一個直徑90 cm、高度50 cm的圓柱形水池構成，水池的水位為29 cm，水溫(24±1)℃。利用藍色墨水染色，使其顏色呈現出不透明狀態。在水池之中，設置一個高度為28cm，直徑為9.5 cm的圓柱形平臺，并確保這個平臺可以移動，并使其頂部沒于水下1 cm處。將水池內的空間劃分為4個象限，在第三象限的中央放置此平臺；對其他3個象限進行特殊標記，確保整個實驗過程中不發生位移。首先將大鼠置入水池2 min，熟悉水迷宮環境。隨機將32只癡呆組大鼠分為4個亞組，每組8只，分別在缺血1 w、2 w、3 w、4 w后分別進行該實驗，檢測跨越平臺次數、逃避潛伏期及游泳路程〔6〕。對照組在與研究組同步的時間點分別各取8只，測定相關指標。

1.5Nogo-A含量檢測 將各時間點大鼠腹腔注射麻醉，取出腦組織，研磨、離心，取上清液-20℃保存備用。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測，將3、6、12、24 ng/ml濃度的樣品加入酶標板上的標準孔中。將10 μl的待測樣本及40 μl的樣本稀釋液加入到樣本孔之中。每孔加入辣根過氧化物酶標記的抗體100 μl，封膜、水浴保溫60 min。每孔加滿、甩去洗滌液并拍干，加底物 A、B各50 μl，避光孵育15 min，加終止液50 μl，在450 nm的波長下測量各孔OD值即吸光度值，繪制酶標曲線，計算樣本濃度。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.2各組水迷宮測試相關指標比較 各組大鼠空間探索實驗軌跡圖見圖1。缺血1、2、3、4 w時，癡呆組跨越平臺次數顯著低于對照組(P<0.05)，逃避潛伏期、游泳路程顯著高于對照組(P<0.05)，見表1～3。

圖1 各組水迷宮測試空間探索實驗軌跡圖

表1 各組跨越平臺次數的比較次)

表2 各組逃避潛伏期比較

表3 各組游泳路程比較

2.2各組Nogo-A含量比較 缺血1、2、3、4 w時，癡呆組腦組織Nogo-A含量顯著高于對照組(P<0.05)；且缺血2 w時腦組織Nogo-A含量最高，見表4。

表4 兩組不同時間點腦組織液中Nogo-A含量的比較

3 討 論

關于慢性腦缺血的發病機制研究較少〔7〕，研究成果也有限。慢性腦缺血引起的繼發性血管性癡呆較為常見，其在發病初期可表現為認知、學習能力下降，最后引起持久性認知及神經功能損傷。慢性腦缺血的重要病理改變為腦白質疏松，缺氧引起神經纖維稀疏、軸突減少，膠質細胞大量增生、血腦屏障破壞。中樞神經系統損傷后常難以再生，其具體原因尚不完全清楚且較為復雜，多種神經細胞因子及蛋白分子參與其中〔8〕。相關學者研究發現〔9～11〕，中樞神經系統損傷后常伴有促神經生長因子合成、分泌顯著降低，而生長抑制性神經因子顯著增高或過表達，如軸突抑制因子Nogo-A、少突膠質細胞白多糖(OMgp)等〔12〕。因此，分析和探討Nogo-A對神經再生的影響對于腦缺血致血管性癡呆的研究具有重要意義。

神經組織對缺血、缺氧極其敏感，導致能量代謝減低，代謝障礙嚴重者甚至無法滿足神經組織正常需求，從而發生一定程度的認知、學習功能障礙。筆者研究發現，癡呆組大鼠學習、認知能力均損傷；同時，隨著慢性腦缺血時間延長，大鼠學習、認知能力還有逐漸下降的趨勢。癡呆組大鼠Nogo-A含量顯著增高，可提示其抑制神經纖維再生可能是導致大鼠認知功能減退或障礙的重要因素之一〔13，14〕。相關學者研究發現〔15〕，哺乳動物神經細胞受損后可伴有一定程度的Nogo-A過表達，通過Nogo-A中和抗體促進神經軸突細胞生長，恢復其相應的神經功能。

因此，慢性腦缺血導致認知功能障礙，且隨缺血時間延長呈進行性發展，Nogo-A表達升高可能是神經細胞功能恢復緩慢的重要因素之一。