斯鈣素-1在慢性阻塞性肺疾病平滑肌增殖中的作用研究

許家艷 楊 捷 喬云飛 楊俊俊 徐興祥

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見的以持續氣流受限為特征的疾病[1]，氣道重塑是導致氣流受限的重要病理學改變，這也是COPD患者病變無法逆轉的重要原因之一[2]。氣道重塑主要表現為氣道平滑肌增殖、基質膠原沉積、上皮下纖維化、上皮間充質轉化、杯狀細胞增生、網狀基底膜增厚等病理改變[3]。在這些病理變化中，氣道平滑肌的改變被認為是導致COPD氣道重塑形成的關鍵因素。氣道平滑肌可表達和釋放多種細胞因子及蛋白酶類，如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)等，這些因子在COPD氣道重塑中發揮了主要作用，研究表明，這些因子的表達調控涉及鈣離子的參與[4]。與此同時，有研究指出尼古丁可通過誘導鈣離子內流促進平滑肌細胞增殖[5]。上述研究表明，細胞內鈣離子水平與COPD氣道重塑形成密切相關。

斯鈣素-1(stanniocalcin-1, STC1)是一種新近發現的能夠抑制鈣離子內流的分泌型糖蛋白[6-8]，在肺內可表達于支氣管上皮細胞。結合課題組前期研究發現STC1能夠抑制支氣管上皮細胞間充質轉化，提示STC1可能通過抑制鈣離子內流抑制平滑肌增殖，在COPD氣道重塑的形成過程中發揮保護性作用[9-10]。本研究擬通過體內及體外研究，探索STC1在COPD中的表達情況及其對氣道平滑肌增殖的影響。

材料與方法

一、實驗材料

人原代平滑肌細胞(HASMCs)來源于美國Sciencell公司。胎牛血清(FBS)購自美國Sciencell公司。STC1抗體購自美國Genetex，α-平滑肌動蛋白(α-SMA)購自英國Abcam。人重組STC1蛋白購自捷克biovendor。

二、實驗動物及分組

實驗動物為選取6周體重約18～22 g的SPF級BALB/c雌性小鼠24只，將小鼠隨機分為4組：1周空氣對照組(簡稱1周空氣組)、1周臭氧暴露組(簡稱1周臭氧組)、3周空氣對照組(簡稱3周空氣組)、3周臭氧暴露組(簡稱3周臭氧組)。每組6只，分籠飼養。

三、實驗方法及檢測指標

1. 動物模型的制備： 將BALB/c小鼠適應性飼養1周后，將臭氧暴露組小鼠暴露在臭氧發生器(南京沃環臭氧科技有限公司，V8016Z)中3 h，臭氧濃度控制在2.5～3.0 ppm，每周3次，1周臭氧組共1周，3周臭氧組共3周。將空氣對照組小鼠暴露在正常的空氣中。

2. 肺組織病理檢測： 取各組小鼠左肺中葉肺組織迅速放4%多聚甲醛液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，然后用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學顯微鏡觀察。

3. 免疫組化檢測α-ASM及STC1的表達及分布： 將肺組織用4%多聚甲醛固定24 h，經梯度酒精脫水后石蠟包埋，切片機制作厚度0.4 mm石蠟切片，并將其固定于載玻片上；烘片后依次以枸櫞酸鹽微波抗原修復及3%的過氧化氫溶液室溫各10 min，PBS 溶液洗滌3次；10%山羊血清37 ℃孵育1 h，加一抗過夜; 以生物素標記的二抗37℃孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌3次；DAB顯色，控制時間; 以自來水終止顯色；蘇木精染色1 min；再以自來水沖洗，鹽酸酒精分化，沖洗，PBS返藍20 min鏡檢；脫水，透明，樹脂封片。Image-pro plus 6. 0軟件分析免疫組化圖片: 每組切片隨機挑選5個200或者400倍視野進行拍照。α-ASM、STC1抗原陽性染色為胞質棕黃色。應用Image-pro plus 6. 0 軟件對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值( IOD值)。

4. EdU染色檢測平滑肌細胞增殖： 按照說明書進行。

四、統計學方法

結 果

一、COPD小鼠支氣管上皮基底膜增厚

HE染色顯示1周及3周臭氧組小鼠肺泡間隔距(平均線性截距LM)較空氣組均明顯增大(圖1，**P<0.01，***P<0.001)，且3周臭氧組小鼠肺泡間距較1周臭氧組進一步增大，差別有統計學意義(圖1，*P<0.05)。說明臭氧暴露小鼠成功誘導肺氣腫。同時，臭氧暴露小鼠顯示支氣管周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、支氣管壁明顯增厚(圖2)。較空氣組及1周臭氧組相比，3周臭氧組小鼠基底膜均明顯增厚，差別有統計學意義(圖2，均*P<0.05)。

二、臭氧暴露小鼠肺組織α-SMA表達增加

免疫組化染色顯示3周臭氧組小鼠肺組織平滑肌細胞標志物α-SMA表達較空氣組及1周臭氧組均明顯增加，差別有統計學意義(圖3，**P<0.01)。

三、臭氧暴露小鼠支氣管上皮STC1表達增加

免疫組化染色顯示STC1主要表達于小鼠支氣管上皮頂端膜，1周及3周臭氧組小鼠支氣管上皮STC1表達較空氣組均明顯增大，差別有統計學意義(圖4，*P<0.05)。但3周臭氧組較1周臭氧組支氣管上皮STC1表達無明顯差異。

圖1 小鼠病理學檢測結果；注：A: 1周空氣組和1周臭氧組；B: 3周空氣組和3周臭氧組(HE×200)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 小鼠基底膜厚度；注：A：1周空氣組和1周臭氧組；B：3周空氣組和3周臭氧組(HE×200) ；箭頭指示基底膜。*P<0.05

圖3 小鼠肺組織中α-SMA的表達水平；注：A：1周空氣組和1周臭氧組；B：3周空氣組和3周臭氧組(HE×400) ；箭頭指示α-SMA表達部位。 **P<0.01

圖4 小鼠支氣管上皮STC1的表達水平；注：A：1周空氣組和1周臭氧組；B：3周空氣組和3周臭氧組(HE×200) ；箭頭指示STC1表達部位。 *P<0.05

圖5 小鼠肺組織中STC1/α-SMA的水平。 *P<0.05

圖6 STC1對平滑肌細胞增殖的影響；注：A：Edu染色檢測STC1對平滑肌增殖的影響；B：SPSS20.0計算EdU染色。**P<0.01，***P<0.001

四、臭氧暴露小鼠肺組織中STC1/α-SMA的水平

計算上述免疫組化染色肺組織STC1相對于α-SMA表達，結果顯示:與空氣組相比，1周臭氧組小鼠肺組織STC1表達較α-SMA升高，隨時臭氧暴露時間延長，3周臭氧組小鼠肺組織STC1表達較α-SMA下降，且與1周臭氧組相比，3周臭氧組小鼠肺組織STC1表達較α-SMA明顯下降，差別有統計學意義(圖5，*P<0.05)。

五、STC1對平滑肌細胞增殖的影響

EdU染色顯示2%FBS及10%FBS均成功誘導平滑肌細胞增殖，且10%FBS效應更明顯，差別有統計學意義(圖6，**P<0.01，***P<0.001)。外源加入STC1重組蛋白均抑制了2%FBS及10%FBS誘導的平滑肌增殖，差別有統計學意義(圖6，**P<0.01，***P<0.001)，STC1本身對平滑肌增殖無效應。

討 論

本文結果顯示，與既往研究相同，臭氧暴露小鼠顯示肺部炎癥、肺氣腫及氣道重塑(肺組織基底膜增厚及平滑肌細胞標志物α-SMA表達增加)等COPD典型特征。在此模型基礎上，我們首次發現STC1在COPD小鼠支氣管上皮中表達升高，但隨著臭氧暴露3周，肺組織STC1表達較α-SMA下降。進一步發現，外源加入rhSTC1能夠抑制平滑肌細胞增殖。結合前期研究，顯示STC1能夠抑制上皮間充質轉化(EMT)發生，提示STC1 在COPD氣道重塑中發揮一定作用。

氣道重塑是由于肺組織反復損傷修復導致氣道壁結構改變，涉及多種細胞，包括上皮杯狀細胞增生、上皮下膠原沉積及纖維化、網狀基底膜增厚和氣道平滑肌細胞增殖等，在COPD中造成不可逆的氣流受限，患者肺功能下降。其中，氣道平滑肌在氣道重塑過程中發揮重要作用。平滑肌細胞發生增生、肥大、遷移，同時表達和釋放多種細胞因子、生長因子和蛋白酶類導致上皮下基底膜增厚及細胞外基質沉積，引起氣道重塑[3]。近年來相關研究表明，GOLD3和4級的COPD患者其平滑肌數量增加接近50%，且與肺功能呈明顯負相關。本研究中，臭氧暴露小鼠顯示杯狀細胞增生、支氣管壁增厚、基底膜增厚、平滑肌細胞增殖等氣道重塑改變。

研究表明，氣道平滑肌增殖與多種信號通路有關，主要包含 EGFR、PDGF、 TGF-β[11]，近年來發現，鈣離子信號也是其機制之一，且鈣離子參與TGF-β的表達調控，同時在COPD中發現存在鈣離子激活現象[12]；上述現象高度提示鈣離子信號與COPD平滑肌增殖密切相關。STC1最初是在硬骨魚腎臟發現的一種鈣離子調節蛋白，研究發現，去除硬骨魚腎臟的斯坦尼氏小體后，腮腺攝取鈣離子增多，出現高鈣血癥，說明斯坦尼氏小體中存在鈣離子調節蛋白。Wagne等[6]在1986年提純了該蛋白，經實驗發現該蛋白能夠抑制鈣離子內流，后將該蛋白命名為斯鈣素。STC1可作用于鈣離子通道蛋白，如瞬時受體電位(transent receptor pathway，TPR)通道，抑制其表達[13]。近年來有關于TPR家族蛋白在COPD中研究是一大熱點。實驗發現，TPR通道蛋白在COPD中高表達，促進氣道炎癥及氣道重塑發生。結合本研究結果，提示STC1可能通過作用于鈣離子通道蛋白(如TRP)抑制鈣離子內流，從而抑制平滑肌細胞增殖。

有研究表明，STC1是一種應激性蛋白[14]，可表達于支氣管上皮細胞，但其在COPD中表達水平尚不明確。本研究發現，在COPD小鼠中STC1表達升高，可能是一種應激反應，隨著臭氧暴露3周，肺組織STC1表達較α-SMA下降，表明體內STC1蛋白表達不足以抵制氣道重塑發生，外源給予足量的STC1可能改善氣道重塑進程。

綜上所述，STC1作為一種鈣離子調控蛋白，在COPD支氣管上皮反應性表達增高，可能作為一種保護機制，抑制氣道平滑肌增殖，外源給予足量的重組STC1可能改善COPD患者氣道重塑進程，有望成為COPD患者治療的新靶點。