線粒體DNA在非小細胞肺癌中的研究進展

白翠青 左志通 陳寶華 宋 勇

研究認為腫瘤的生物學特性不僅與細胞核內遺傳物質有關，而且與細胞核外的遺傳物質即線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)有關。越來越多的研究發現多種惡性腫瘤中存在mtDNA的變異，包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)、膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌、前列腺癌等，并且發現mtDNA的變異與這些腫瘤的發生發展密切相關。本文對mtDNA在非小細胞肺癌中的研究進展做一綜述。

一、mtDNA

1. mtDNA的結構和特點： 線粒體是真核細胞進行氧化磷酸化產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的細胞器，其與能量代謝、細胞凋亡、氧化應激等生物學活動密切相關，它擁有獨立于細胞核基因組之外的遺傳物質即mtDNA[1]。人類mtDNA由16 569個核苷酸對組成，呈雙鏈閉合環狀，包含一條輕鏈和一條重鏈，大部分編碼基因位于重鏈上，負責編碼12個線粒體呼吸鏈酶復合物結構亞基、12S及16S線粒體核糖體RNA (ribosomal RNAs, rRNAs)和14個線粒體轉運RNA( transfer RNAs, tRNAs)，輕鏈僅編碼8種tRNA和1種線粒體呼吸鏈酶復合物結構亞基[2-4]。mtDNA呈母系遺傳，線粒體內蛋白質的合成受mtDNA控制，在編碼區，幾乎每一個堿基都在基因的拼接過程中起著重要作用[5]，因此編碼區一旦有基因突變，mtDNA的序列就會發生改變，進而導致mtDNA編碼蛋白的改變，線粒體功能紊亂，最終導致人體致病。人體大多數細胞包含103～104拷貝數的mtDNA，與核DNA (nuclear DNA, nDNA)相比，mtDNA缺乏組蛋白保護、位置靠近線粒體內膜易受活性氧 (reactive oxygen species, ROS)損傷、損傷修復能力低，因此突變率比nDNA高[4]。高拷貝數、高突變率是mtDNA區別于nDNA的兩大主要特點。在mtDNA的16024-576bp之間有一個1124bp長的非編碼區又稱之為D環(displacement loop, D-loop)，占全部mtDNA的6%左右，包含調控mtDNA重鏈、輕鏈轉錄和復制的因子[6]。D-loop區是一個包含2條輕鏈和1條重鏈的3鏈結構，富含A-T堿基，在這個區有2個超高變異率區(high-variable regions, HV:HV1，位于16024-16383；HV2位于57-372)，其堿基替換率比其他區域高5～10倍，絕大多數突變發生在此區，被稱為熱點[7]。突變mtDNA的數目達到一定程度可引起某些組織或器官的功能異常。

2. mtDNA與疾病： 人類mtDNA已經被全部測序，線粒體編碼基因也已經確認。在一些神經退行性疾病、嬰兒猝死綜合征中都發現了mtDNA的變異。在實體腫瘤和血液腫瘤中也都發現了mtDNA變異，可能原因為mtDNA變異導致線粒體的功能障礙和細胞易感性，進而導致腫瘤發生[8]。mtDNA變異包括mtDNA拷貝數的變化和mtDNA的基因突變。研究表明mtDNA變異不僅與腫瘤的發生發展相關，而且與治療的敏感性相關[9-11]。

二、NSCLC中mtDNA拷貝數的變化

mtDNA拷貝數是指mtDNA在線粒體基因組中的個數，每個線粒體約含有2～10個mtDNA拷貝數，正常人體每個體細胞mtDNA拷貝數為103～104，不同組織類型中mtDNA的拷貝數不同。 線粒體功能的發揮與線粒體中mtDNA的拷貝數密切相關。研究表明不同類型的腫瘤，mtDNA拷貝數的變化不同。

1. mtDNA拷貝數發生變異的可能機制： 一方面mtDNA D環區的調節因子發生變異時，mtDNA的復制和轉錄可能會發生改變，進而導致mtDNA拷貝數下降；另一方面，高水平的ROS導致氧化損傷因子8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-oxo-G)產生，同時8羥-基鳥嘌呤DNA糖苷酶1滅活和DNA聚合酶γ缺乏導致mtDNA損傷修復失敗，mtDNA拷貝數改變，ROS介導的損傷補償機制也會影響mtDNA拷貝數[12]。

2. NSCLC中mtDNA拷貝數的變化特點及與NSCLC風險的關系： 研究發現，與癌旁組織相比，肺癌患者癌組織中mtDNA拷貝數顯著下，且與D-loop區突變相關[13-14]。大多數腫瘤其腫瘤組織的mtDNA拷貝數相對于癌旁正常組織是下降的，但是肺腺癌組織相對于癌旁正常組織mtDNA拷貝數是增加的[15]。由此推測NSCLC組織中mtDNA拷貝數可能與組織類型有一定關系，需要更多臨床試驗去證實。有研究對云南宣威地區的肺癌患者進行了病例對照研究，入選122例原發性肺癌患者和122例對照組患者，分別收集其晨起痰液，從痰液中提取mtDNA進行定量RT-PCR分析，發現mtDNA含量>157拷貝數的患者肺癌風險是拷貝數<157拷貝數患者的2倍，提示mtDNA拷貝數與肺癌風險呈正相關，并且發現這種關系僅限于大于57歲的高齡患者[16]。Hosgood 等[17]對來自芬蘭的227例肺癌患者和227例對照患者進行了一項前瞻性隊列研，對研究組和對照組全血中的mtDNA進行熒光定量PCR分析，也發現mtDNA高拷貝數與肺癌風險相關，并且呈劑量依賴性關系，尤其在重度吸煙患者中更明顯。然而一項前列腺癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌篩查試驗(prostate lung colorectal and ovarian, PLCO)和一項上海市區非吸煙女性肺癌危險因素的研究(Shanghai Women′s Health Study, SWHS)均發現mtDNA拷貝數與肺癌風險無關[18-19]。Kim等[20]對合并了三項關于mtDNA拷貝數與肺癌風險的研究進行分析，結果仍發現mtDNA的拷貝數與肺癌風險無關。Meng等[21]進行了一項前瞻性的病例對照研究，納入463對病例對照組，分析外周血白細胞mtDNA拷貝數與肺癌風險的關系，發現重度吸煙患者mtDNA拷貝數比從不吸煙者更低，且發現在吸煙患者中，中等mtDNA拷貝數組的患者肺癌風險為高拷貝數組的2倍，但在低拷貝數組未發現肺癌風險。由此可見NSCLC中存在mtDNA拷貝數的變化，但是其增高還是降低以及拷貝數變化與肺癌風險的關系目前仍有爭議，可能與樣本量少、mtDNA來源不同、對照不同等相關，需要更大樣本量、更統一標準的研究去探索。

3. mtDNA拷貝數是NSCLC潛在的無創輔助診斷手段： 目前液體活檢已在臨床有應用，比如通過測定血液中循環游離nDNA的濃度，可初步鑒別良惡性疾病。相對于nDNA，mtDNA具有長度較短、分子結構簡單、拷貝數大等特點，更易于檢測，因此是潛在的腫瘤早期檢測分子標志物。Hou等[22]在一個小樣本量的臨床試驗中發現，NSCLC患者的血清mtDNA水平與良性肺部疾病及健康人群相比顯著升高，并且發現與TNM分期密切相關，晚期NSCLC患者血清的mtDNA水平較早期患者顯著升高，但血清mtDNA水平與患者的性別、年齡、組織病理學類型、淋巴結轉移無關，ROC曲線(receiver operating characteristic, ROC)發現血清mtDNA水平可用來鑒別良惡性肺部疾病，其臨界值為 0.74×104拷貝數/μl ，敏感性和特異性分別為86.2%和80.7%，這說明血清mtDNA是NSCLC的一個潛在無創性的分子標志物，但需要更多更大樣本量的臨床試驗支持。

4. mtDNA拷貝數與NSCLC的治療效果及預后的關系： Lin等[23]對29例N2陽性Ⅲ期新輔助化療NSCLC患者的術后肺癌組織mtDNA拷貝數進行回顧性分析，發現mtDNA拷貝數降低與化療后疾病進展有關，可能的機制為mtDNA拷貝數降低，提示線粒體密度降低，進而ROS產生減少，ROS誘導的細胞分化和凋亡功能減弱，進而促進腫瘤進展。 Huang等[24]在一個小樣本量的給予厄洛替尼治療的肺腺癌患者中測定其治療前后外周血中的游離mtDNA濃度，并且評估了血漿mtDNA的潛在預后價值，結果發現疾病進展或者是對厄洛替尼無效的患者外周血中mtDNA濃度較治療前顯著降低，部分緩解的患者外周血mtDNA濃度與治療前相似或升高，外周血mtDNA濃度與疾病無進展生存期無關，腫瘤EGFR的突變狀態也與外周血mtDNA無關。對厄洛替尼治療有效的患者，其治療后外周血mtDNA濃度較前升高的可能原因為厄洛替尼破壞了腫瘤細胞，從而釋放大量mtDNA到外周血。由此表明治療后腫瘤組織或血清中的mtDNA拷貝數降低可提示治療療無效或疾病進展，而mtDNA拷貝數升高則提示治療有效。Xu等[25]對128例NSCLC患者進行研究，其mtDNA從手術標本中分離，發現高拷貝數mtDNA的患者中位OS為34.1個月，而低拷貝mtDNA患者的OS為27.9個月，兩者具有統計學差異，這表明高拷貝數mtDNA的患者預后比低拷貝數mtDNA患者的預后好，低mtDNA拷貝數是NSCLC預后差的一個因素。由此可見，mtDNA拷貝數在評估NSCLC治療效果及預后方面有一定作用。

三、NSCLC中mtDNA的突變

1. mtDNA突變與腫瘤發生的可能機制： 目前普遍認為mtDNA突變參與腫瘤形成，但其確切機制尚不明確。目前認為可能的機制有：一方面，mtDNA突變達到一定程度，可直接或間接引起線粒體呼吸鏈功能障礙，細胞內能量減少，細胞和組織缺少生物學能量而不能維持正常的功能進而導致細胞癌變，腫瘤生成；同時線粒體是內源性ROS產生的主要來源，mtDNA突變后ROS產生增加，線粒體氧化應激增加，誘導細胞癌變[26]。另一方面，線粒體通過調節電化學梯度誘導細胞凋亡，mtDNA突變引起電化學梯度增高，線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, mtPTP)關閉，阻止了程序性細胞死亡因子的釋放，導致腫瘤細胞抗拒凋亡[27-28]。

2. NSCLC中mtDNA的突變特點： 研究表明在許多腫瘤中存在D-loop區mtDNA的突變，這些突變包括303-309位點均聚物C片段( homopolymeric C tract, PCT)數目的變化和單一的堿基置換(single base substitutions, SBS)。在手術切除的NSCLC中，D-loop區SBS頻率是7～29%，PCT改變是16%[29]。Suzuki[6]等對28個肺癌細胞系和55例手術切除的NSCLC組織進行D-loop區測序，發現29%的細胞系有SBS，并且是同質性的，50%的細胞系有PCT改變，8個細胞系是同質的，95%的SBS出現在D-loop區的高突變區，在55例手術切除的NSCLC組織中，20%有PCT改變。Matsuyama[30]等研究了202例NSCLC患者的病理標本，發現70例NSCLC患者的腫瘤細胞mtDNA在D-loop區有各種突變，其中16117A-T和16368A-T突變率最高，并且突變與性別、年齡、吸煙指數、組織類型等無關，ⅢB期和T3以上分級的患者突變率更高。Jin等[31]對55例肺癌患者的外周血mtDNA進行分析，發現60%的患者外周血mtDNA存在突變，共發現56例突變，包括48例點突變、4例單核苷酸插入突變、4例單核苷酸缺失突變，同時也與上述研究相一致，發現mtDNA突變與性別、年齡、吸煙史、腫瘤類型、腫瘤分期等無明顯關系。與此相反， Dasgupta等[32]分別對30例從不吸煙和目前吸煙的肺癌患者進行研究，發現與當前吸煙的患者相比，從不吸煙患者的mtDNA突變率更高，并且發現在從不吸煙的患者中，mtDNA的突變顯著與EGFR(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變相關，具有EGFR基因突變者的mtDNA突變率更高。Kazdal等[33]分析了352例NSCLC的mtDNA突變和突變的空間分布，發現了456種不同的mtDNA突變，這些突變隨機分布在整個mtDNA基因上，重復率很低，突變頻率最高的是G16390A，占1.7%，說明mtDNA突變在NSCLC中可能僅僅是乘客突變，而不是驅動突變，這對mtDNA相關的靶向治療產生了挑戰。

3. mtDNA突變與NSCLC風險及預后的關系： mtDNA單倍型類群是發生特異性變異的mtDNA，Zheng等[34]對422例肺癌患者進行病例對照研究，發現單倍型類群D和F是肺癌的保護性因素，單倍型G和M7是肺癌的危險因素，并且發現相對于對照組肺癌患者的mtDNA 822缺失頻率更高，多變量分析發現吸煙是mtDNA 822缺失的危險因素。Wang等[35]對250例韓國的NSCLC研究，發現單倍體(D/D4)與早期NSCLC的OS差相關。 Matsuyama等[36]研究了202例NSCLC患者，發現70例NSCLC患者的腫瘤細胞mtDNA在D-loop區有各種突變，在ⅢB期和Ⅳ期的患者中，有突變的相對于未突變的預后更差。研究發現mtDNA的D-環區單核苷酸多態性位點235A/G和324A/G與NSCLC風險增加有關，并且發現等位基因16390是NSCLC預后的獨立因素，等位基因為16390A的患者OS比16390G的患者短[37-38]。Koshikawa等[39]在一個小樣本量的NSCLC臨床標本中測定線粒體NADH脫氫酶亞基基因，發現線粒體NADH脫氫酶亞基基因的突變可導致線粒體復合體Ⅰ活性下降，并且發現其突變率與NSCLC的遠處轉移顯著相關。Qi等[40]在一個小樣本量的手術切除的NSCLC組織標本中發現高水平的mtDNA10398G突變組患者的預后較低水平突變組的預后好，高水平突變組的平均OS為28.7個月，而低水平突變組OS為22.5個月，兩組有統計學差異，表明低水平的mtDNA10398G突變變是NSCLC預后差的一個因素。一個小樣本量研究發現高拷貝數mtDNA同時有10398G突變的患者中位OS為47.3個月，而低拷貝數且10398A突變的患者中位OS為26.3個月，兩者具有統計學差異，這表明低mtDNA拷貝數和10398A突變是NSCLC預后差的因素。可能的原因為mtDNA拷貝數降低和10398突變導致mtDNA功能紊亂，從而影響腫瘤的生物學行為以及影響治療的敏感性，進而導致預后差。

上述研究表明NSCLC中存在mtDNA突變，但尚未發現特異性的突變，且突變頻率及突變的的相關影響因素，mtDNA突變與NSCLC風險和預后的關系尚無統一結論，尚需更多的研究去完善。

四、mtDNA與NSCLC的治療

最近研究表明在未來靶向線粒體是治療肺癌的有效手段。肺癌細胞很大程度上依賴線粒體呼吸功能，一些研究表明抑制線粒體功能是治療肺癌的一項有效措施。使用線粒體抑制劑后肺癌細胞會對藥物敏感，而且會使腫瘤細胞缺少ATP而處于饑餓狀態，影響腫瘤的生長和轉移,而健康細胞的氧化磷酸化水平較低，對能量的需求水平低，所以不會受影響。一些線粒體抑制劑如環巴胺酒石酸鹽、二甲雙胍、microRNA-126、BAY 87-2243可以通過一定的分子機制干擾腫瘤細胞的線粒體功能，進而抑制腫瘤[41]。而上調mtDNA和生物合成基因則與肺癌發病相關。目前靶向基因治療的臨床研究絕大多數集中于nDNA，在一些細胞水平或動物實驗中有靶向mtDNA的研究。BAY 87-2243 是一種有效的選擇性的缺氧誘導因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)抑制劑，體外細胞實驗表明BAY 87-2243可通過抑制線粒體復合體I進而抑制HIF-1的活化，從而抑制NSCLC細胞系H460的增殖[42]。Szczesny等[43]體外實驗發現mtDNA的修復需要硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)調節，抑制H2S的合成可以通過抑制mtDNA的修復使肺腺癌細胞對化療藥物敏感。Trivedi等[44]將包含有microRNA-34a的透明質酸納米粒轉入到A549肺腺癌細胞的線粒體中，發現成功轉入后，細胞的ATP水平發生了改變，糖酵解、核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2) 、谷胱甘肽等的水平降低了，最終導致半胱氨酸酶激活，腫瘤細胞凋亡，其潛在的分子機制為導入的microRNA-34a改變了mtDNA D環區的基因狀態和編碼區的基因轉錄進而導致上述改變。

綜上所述，在NSCLC中存在mtDNA拷貝數和基因的變異，提示mtDNA的變異可能在NSCLC的發生發展過程中存在一定作用，但具體作用機制及是否能將mtDNA作為診斷NSCLC的分子標志物以及其與臨床預后的關系、治療需要更深入的探索。