酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚生長、非特異性免疫及腸道結構的影響

陳福艷，歐陽賢華，黎建斌 ，黃彩林，李大列，雷愛瑩，黃 婷，黎 銘 *，梁萬文 *

(1. 廣西水產科學研究院/廣西遺傳育種與健康養殖遺傳重點試驗室，廣西 南寧 530021； 2. 廣西芳草安桂生物科技有限公司，廣西 南寧 530001；3. 廣西壯族自治區水產引育種中心，廣西 南寧 530031)

【研究意義】羅非魚是全球養殖最廣泛的淡水魚類之一，具有適應能力強、生長快速、養殖周期短、易于飼養、出肉率高、無肌間刺、蛋白質豐富和肉質鮮美等優點[1]。我國的羅非魚養殖經過多年的發展已具規模，但隨著羅非魚養殖規模的擴大和養殖密度的增加，養殖環境惡化的問題日趨嚴重，羅非魚病害頻繁爆發，如鏈球菌病、肝膽病、車輪蟲病和腸炎等，給羅非魚養殖業造成了較大經濟損失[2]。近年來，羅非魚還出現腸道方面的問題，如拉長條形帶粘膜的糞便，中后腸道透明易破裂，和消化不良等癥狀，這些癥狀一般會影響羅非魚生長，嚴重的還會導致死亡[3-4]。目前羅非魚的病害防治主要依賴抗生素，然而大量使用抗生素帶來了細菌耐藥性和藥物殘留等問題。因此研究多糖和中草藥等天然藥物或免疫增強劑，提高羅非魚的抗病能力，促進生長，是當前羅非魚養殖業研究的重要方向。【前人研究進展】酵母多糖是酵母菌和真菌細胞壁的重要組成部分，主要由β-葡聚糖、甘露寡糖和糖蛋白等物質組成[5]。大量研究表明，酵母多糖具有促進生長、增強機體免疫、抗病毒和抗腫瘤等生物學功能[6]。中藥是人類使用歷史悠久的天然藥物，含有多種可增強機體的免疫功能的有效成分。中藥具有資源豐富、毒副作用小、抗藥性不顯著、以及性能多樣等優點,并含有多種增強機體免疫機能的活性成分，可根據需要配伍成多種復方，使其在臨床上的應用具有廣泛性和選擇性[7]。有研究表明，在飼料中添加酵母多糖可提高多種魚類的免疫力，包括赤眼鱒[8]、鯉魚[9]、斑點叉尾鮰[10]、黃顙魚[11]、草魚[12]等。王中清等[13]研究發現在飼料中添加酵母多糖可以提高鯽魚血清AKP與SOD活力，用嗜水氣單胞菌攻毒結果試驗組鯽魚感染率均低于對照組的感染率。關于中草藥提高魚類免疫功能的研究報道也比較多，例如：溫周瑞等[14]將杜仲、當歸、黃芪、枸杞等10味中草藥均勻粉碎后配制成復方制劑添加到飼料中投喂羅非魚，發現可以提高羅非魚的非特異免疫力。劉紅柏等[15]在飼料中分別添加黃芪、茯苓、魚腥草和板蘭根均可使鯉魚的白細胞吞噬率、吞噬指數和紅細胞C3b受體花環率升高。曲亞玲等[16]研究發現在虹鱒魚飼料中添加中草藥復合添加劑富康163能促進虹鱒魚體生長,提高營養物質利用率。張耀武等[17]研究發現基礎飼料中添加成分為黃芩、茯苓、板藍根、黃芪、大黃、甘草、金銀花的復方中草藥制劑，可顯著提高黃顙魚生長、血細胞的吞噬活性、溶菌酶活力。馮娟等[18]研究發現在飼料中添加板藍根、大青葉、連翹、黃芪、藿香和沙打旺等組成的中草藥混合劑可有效提軍曹魚稚魚的溶菌酶活力和白細胞殺菌活力，降低鯊魚弧菌對軍曹魚的致死率。邢玉娟等[19]研究發現，在基礎飼料中添加成分為黃芪、甘草、板藍根、大青葉等的復合中草藥可提高草魚的白細胞吞噬能力、組織溶菌酶及超氧化物歧化酶活性，增強非特異性免疫功能。曲木等[20]研究發現，用含黃芪、黨參、野菊花的復方中草藥的飼料飼喂黃顙魚后，試驗組黃顙魚增重率、特定生長率顯著升高，餌料系數顯著降低，組織中補體C3和補體C4含量明顯增高。這些研究發現在魚類飼料中添加酵母多糖或中草藥制劑均可提高魚類的非特異性免疫功能，提高魚類抗病能力，因此建議在養殖飼料中添加加酵母多糖或中草藥制劑。【本研究切入點】目前尚未有酵母多糖對羅非魚生長和免疫功能影響的研究報道，未有酵母多糖或中藥對魚類腸道結構的影響的研究報道，也未有酵母多糖-中藥復合制劑對魚類生長和免疫功能的影響的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以羅非魚為研究對象，探討酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚生長、非特異性免疫及腸道結構的影響，為羅非魚的健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 制劑制作

酵母多糖產品購于安琪酵母股份有限公司，成分：水分≤8.0 %，甘露聚糖≥20.0 %，β-萄聚糖20.0 %～35.0 %，溶解率≥45.0 %；黃芪多糖免疫草產品購于成都芳水生物科技有限公司，主要成分：黃芪多糖提取粉、甘草、絞股藍等；魚腥草和甘草等中草藥購自南寧市某藥店，產自廣西。酵母多糖-中草藥復合制劑組方經過藥師指導設計和預備試驗篩選，主要成分為酵母多糖45 %、魚腥草35 %、甘草15 %和黃芪多糖5 %。酵母多糖-中草藥復合制劑的制備方法為：中草藥分別用破壁機粉碎成60目粉劑，然后按比例混合，用開水浸泡30 min浸出有效成分，水的添加量為飼料量的5 %，然后按比例加入酵母多糖，攪拌均勻，3～10 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗設計

試驗用魚來源于南寧亭子魚苗市場，為海南寶路羅非魚。試驗開始前暫時(15 d)養殖于廣西水產科學研究院水簇樓的1 m3塑料桶中，每個桶配充氣頭2個，養殖用水為經過曝氣的自來水。

試驗魚共240尾，分為對照組、0.05 %組、0.1 %組和0.2 %組，每組試驗魚包含3個生物學重復，每個重復20尾魚(表1)。對照組羅非魚投喂基礎飼料?；A飼料是百洋集團生產的羅非魚顆粒飼料(402#)，成分：粗蛋白30.0 %，粗脂肪3.0 %，粗纖維10.0 %，粗灰分13.0 %，水分12.0 %，賴氨酸1.4 %，鈣0.5 %～2.5 %，總磷0.6 %～2.0 %，氯化鈉0.3 %～1.5 %。試驗組羅非魚的基礎飼料中添加不同比例(表1)的酵母多糖-中草藥復合制劑及0.2 %粘合劑攪拌均勻。試驗開始后，養殖期間每天投喂2次，時間分別為早上8:00，下午5:00，投喂量約為魚體重的2 %。試驗時間為56 d。對照組羅非魚一直投喂基礎飼料；試驗組羅非魚一直投喂添加酵母多糖-中草藥復合制劑的飼料，每逢周日停止添加酵母多糖-中草藥復合制劑1 d，改為投喂基礎飼料。試驗期間，下午投喂飼料30 min后撈養殖水體中的殘餌，吸除糞便，加注新水；定期監測水質pH值、氨氮和亞消酸鹽，視水質情況更換水量。

表1 試驗魚分組

1.3 樣品采集

試驗結束后，將試驗魚饑餓24 h后，對每桶魚進行稱量計數，計數存活和增重率。隨機抽取每桶試驗魚15尾魚，用MS-222麻醉后，進行各項檢測。其中6尾用于抽血，另外6尾魚用于測量體重，另外剪取3尾魚的前腸1.0 cm，置于10 %甲醛短暫(24 h內)固定，用于制作組織切片[21]。

抽血：采用尾靜脈抽血，輕緩操作，防止細胞破裂。制成凝血，即將抽取的血液置于無菌真空離心管，置于4 ℃冰箱靜釋4 h后，4000 r/min離心10 min，取上清液，分裝于2 mL離心管，-80 ℃保存備用，作為血清生化指標和各種酶的測定[22]。

1.4 生長性能的測定

實驗羅非魚的生長性能測定參照文獻的方法進行[21]。

增重率(%)={[末體重(g)-初體重(g)]/初體重(g)}×100

特定生長率(%)={[ln末體重(g)-ln初體重(g)]/時間(d)}×100

飼料系數=攝食飼料總量(g)/[末體重(g)-初體重(g)]

存活率(%)=(成活尾數/總尾數)×100

1.5 血清生化指標的測定

主要測定總蛋白、白蛋白、球蛋白、總膽固醇、谷草轉氨酶、甘油三酯及谷丙轉氨酶等指標的含量，使用日立7020型全自動生化分析儀進行測定。

1.6 血清抗氧化指標的測定

血清中的抗氧化指標主要測定了總抗氧化能力、過氧化氫酶活性、丙二醛含量和一氧化氮含量，均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒根據說明書的方法進行測定。

1.7 血清免疫指標的測定

血清免疫指標主要測量補體C3、補體C4、溶菌酶和淀粉酶。血清中的補體C3和補體C4使用上海酶聯生物技術有限公司試劑盒根據說明書的方法進行測定；血清中溶菌酶和淀粉酶活性使用南京建成生物工程研究所試劑盒根據說明書的方法進行測定。

1.8 腸道結構的顯微鏡觀察

采用常規方法對腸道組織進行石蠟包埋，切片(7 μm)，蘇木精-伊紅染色。在Olympus CX41顯微鏡下觀察，用明美顯微數碼測量分析系統進行拍照及測量，每具腸管取2張切片，每張切片選取3個絨毛高度和肌層厚度進行測量[21]。

1.9 統計分析

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚生長性能、飼料利用率和成活率的影響

由表2可見，各組隨著添加比例的提高增重率和特定生長率都有所提高，其中0.20 %組的增重率和特定生長率顯著高于對照組、0.05 %組和0.10 %組(P<0.05，下同)，但對照組、0.05 %組和0.10 %組間增重率和特定生長率差異不顯著(P>0.05，下同)；0.20 %組的飼料系數隨著復合制劑的投喂量的增加而降低，其中0.20 %組的飼料系數顯著低于對照組、0.05 %組和0.10 %組，但是對照組、0.05 %組和0.10 %組間飼料系數差異不顯著。4組羅非魚的存活率均為100 %。

表2 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚生長性能、飼料利用率和成活率的影響

注：表中數據為平均值±標準差。同行數據后上標不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note： Data in the table is expressed as mean ± standard deviation. Values with different superscripts lowercase letters in the same column are significantly different (P<0.05). The same as below.

2.2 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚血清生化指標的影響

由表3可見，白蛋白含量、谷草轉氨酶濃度和谷丙轉氨酶濃度隨著添加比例的提高有所增加；其中0.20 %組的白蛋白含量、谷草轉氨酶濃度和谷丙轉氨酶濃度含量顯著高于對照組、0.05 %組和0.10 %組，而對照組、0.05 %組和0.10 %組間差異不顯著；0.05 %組的甘油三酯濃度顯著低于對照組，而其他各組間差異不顯著；另外總蛋白含量、球蛋白含量、總膽固醇濃度3個指標在各組間的差異不顯著；0.05 %組的淀粉酶活性與對照組差異不顯著，而0.10 %組和0.20 %組的淀粉酶活性顯著高于對照組和0.05 %組。

2.3 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚血清抗氧化能力的影響

由表4可見，總抗氧化能力濃度和過氧化氫酶在試驗組中隨著添加比例的提高有所增長的趨勢，而一氧化氮為降低的趨勢。其中0.20 %組的總抗氧化能力濃度顯著高于比對照組和0.10 %組；0.20 %組、0.05 %組過氧化氫酶濃度顯著高于對照組和0.10 %組；而0.05 %組、0.10 %組和0.20 %組的一氧化氮濃度顯著低于對照組的，但是丙二醛各組間的差異不顯著。

2.4 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚免疫指標的影響

由表5可見，試驗組的補體C3濃度、補體C4濃度活性和溶菌酶活性隨著添加比例的提高增加有所增長的趨勢。其中0.05 %組、0.10 %組和0.20 %組的補體C3濃度顯著高于對照組；0.10 %組和0.20 %組的補體C4濃度顯著高于對照組和0.05 %組，而0.05 %組的補體C4濃度與對照組差異不顯著；0.05 %組、0.10 %組的溶菌酶活性顯著高于對照組和0.20 %組，而0.20 %組的溶菌酶活性與對照組差異不顯著。

表3 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚血清生化指標的影響

表4 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚血清抗氧化能力的影響

表5 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚免疫指標的影響

2.5 酵母多糖-中藥復合制劑對羅非魚腸道結構的影響

對羅非魚的腸道進行切片和顯微鏡觀測(圖1)，結果表明，在飼料中添加酵母多糖-中藥復合制劑可對羅非魚腸道結構產生影響，腸道絨毛高度隨著添加量的增加而增長，其中試驗組腸道絨毛高度顯著長于對照組；腸道肌層厚度也隨著添加量的增加面增厚，但各組間差異不顯著(表6)。

3 討 論

已經有一些研究發現，在飼料中添加酵母多糖可以提高動物的非特異性免疫功能，促進生長發育[22]，也有研究發現在飼料中添加中草藥可以增加動物的機體免疫功能，提高抗病能力[23]。然而，至今還沒有將酵母多糖和中草藥配伍成酵母多糖-中草藥復合制劑用于飼料添加劑的研究報道。

生長性能和飼料利用率是養殖動物重要的性狀，直接影響到養殖的經濟效益。已經有研究發現，在飼料中添加0.1 %的酵母多糖可以提高鯉魚的相對增重率和攝食速度[9]，還有研究發現，在飼料中添加酵母多糖可以促進豐產鯽的生長[24]。還有一些研究表明，在飼料中添加中草藥能夠促進美國紅魚[25]、黃顙魚[17]和草魚[26]的生長。本研究發現在羅非魚飼料中添加酵母多糖-中草藥復合制劑能有效提高羅非魚的增重率、特定生長率和降低飼料系數。但是各組的成活率差異不顯著，主要原因是試驗魚的數量較少，試驗期間沒有魚死亡，成活率都是100 %，因此顯示不出差別。

A：對照組腸道結構；B：0.05 %組腸道結構；C：0.10 %組腸道結構；D：0.20 %組腸道結構；HM：絨毛高度；HC：肌層厚度A: Intestinal structure chart of control group; B: 0.05 % group; C: 0.10 % group; D: 0.20 % group; MH: Villus height; HC: Muscle thickness圖1 試驗魚腸道組織結構(100倍顯微鏡)Fig.1 Histological chart of intestinal structure of experimental fish (100-fold microscopy)

表6 酵母多糖-中草藥復合制劑對羅非魚腸道結構的影響

血清生化指標和抗氧化能力是衡量動物健康狀況和免疫功能的重要標志。張雪等[27]研究發現在飼料中添加果寡糖和甘露寡糖可以提高大菱鲆幼魚血清的總蛋白含量，降低甘油三酯含量，提高大菱鲆對營養物質的吸收,促進蛋白質和脂類代謝[26]。谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是肝細胞受損最靈敏指標，可以用來評價藥物的毒副作用。陳玉春等[28]研究發現在飼料中分別添加刺五加、蒲公英、枸杞子、金銀花和大蒜單方中草藥對鯉魚血清的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性影響不顯著，說明這些中草藥的毒性不大[28]。本研究在羅非魚飼料中添加酵母多糖-中草藥復合制劑，結果發現能提高羅非魚血清中的白蛋白、總抗氧化能力和過氧化氫酶，而對0.05 %組和0.1 %組的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的提高不明顯，與其他學者的研究報道類似。但是，血清中的總蛋白、球蛋白、總膽固醇和丙二醛等指標的差異不顯著，這可能與制劑的配方以及添加的比例有關，有待將來進一步研究。

補體是存在于動物血清和組織液中的一組不耐熱的經活化后具有酶活性的蛋白質。溶菌酶是一種能水解病原微生物細胞壁中黏多糖的堿性酶。補體和溶菌酶都屬于非特異性免疫功能蛋白，在魚類抵抗病原微生物入侵中發揮著很重要的作用[29]。本研究在羅非魚飼料中添加酵母多糖-中草藥復合制劑，結果發現能提高羅非魚血液中補體和溶菌酶的濃度，而且隨著添加比例的提高，補體和溶菌酶的濃度越高。結果說明酵母多糖-中草藥復合制劑能有效提高羅非魚的非特異性免疫功能。

魚類的腸道對抗病能力和生長至關重要，很多病原微生物都是通過腸道感染魚。腸道還是魚類吸收營養物質的主要器官。因此，保持魚類的腸道結構完整和微生態平衡對魚的生長發育和健康很重要。前尚未有關于酵母多糖或中草藥制劑對魚類腸道的影響的研究報道，但是已經有一些其它動物這方面的研究。例如，張運濤等[30]研究發現，在仔雞的飲用水中添加酵母多糖，在大腸桿菌攻毒條件下，對照組小腸絨毛變形、微絨毛脫落，而試驗組小腸絨毛和微絨毛生長發育正常。賀琴等[31]研究發現在飼糧中添加酵母壁多糖能夠顯著提高仔豬空腸絨毛高度和十二指腸絨毛高度。賀永康等[32]研究發現，在飼糧中添加白頭翁、黃芪、黃連、黨參及大黃等藥材組成的中草藥添加劑，肉雞腸道的絨毛高度比對照組提高了8.52 %～23.04 %。本研究在羅非魚飼料中添加酵母多糖-中草藥復合制劑，發現處理組羅非魚腸道的絨毛高度和肌層厚度都有增加，其中試驗組的絨毛高度顯著高于對照組。其主要原因可能是酵母多糖-中草藥復合制劑提高羅非魚絨毛的生長性能，改善腸道微生態環境，從而也促進腸道的生長發育，而腸道結構的改善又促進羅非魚的生長發育，形成良性循環。但本研究只用了2種中草藥與酵母多糖配伍成復合制劑，將來有待使用更多的中草藥與酵母多糖配伍，探索效果更顯著的組方。

4 結 論

在羅非魚飼料中添加酵母多糖-中草藥復合制劑，能有效提高羅非魚的生長性能和非特異性免疫功能，改善腸道結構。酵母多糖和中草藥復合制劑配伍對羅非魚的生長性能、血清生化指標、血清抗氧化指標、血清免疫指標和腸道結構具有明顯的改善作用，能夠促進羅非魚的生長和提高抗病力。