火棘多糖鐵(Ⅲ)復合物中鐵含量檢測方法的建立

蔣 莉，付啟明，王 磊，蔡易睿，鐘方旭，鄢又玉

武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430023

火棘Pyracanthafortuneana(Maxin.)Li又名救軍糧、火把果、紅子、吉祥果、狀元紅等，是薔薇科蘋果亞科火棘屬的一種常綠植物灌木，主產于云南、貴州、四川、湖南、湖北等地。其中全緣火棘、窄葉火棘、細圓齒火棘等三個品種在湖北分布較廣，資源豐富。目前已被國家衛生部批準作為新食品資源[1]。火棘果資源豐富，每年僅在湖北省的年產量就高達5萬噸[2]。火棘果中含有多種營養成分，如多糖、多酚、果膠、黃酮、原花青素等[3]，其中可溶性多糖的含量占10%～13%左右。在現代科技中，人們將多糖與一些金屬或者非金屬相結合，產生了意想不到的功能效果[4]。

缺鐵性貧血(IDA)是當前發病率最高的營養素缺乏病之一，同時伴有慢性疲勞、煩躁不安、免疫功能紊亂、情緒或認知障礙、記憶力減退等癥狀，嬰幼兒及學齡前兒童缺鐵更有可能影響兒童腦部發育[5，6]。鐵補充劑的發展可分為三代：無機鐵劑，小分子有機鐵劑，多糖鐵復合物。其中一代無機鐵劑的鐵腥味重，生物利用度低；二代小分子有機鐵劑吸收易飽和，有游離鐵毒性，治療周期長[7]；第三代于1947年證明靜脈注射多糖鐵復合物的安全性，多糖鐵復合物可治療缺鐵性貧血[8]。多糖鐵復合物作為鐵元素補充劑在體內具有多糖的多種生物活性、普遍耐受性與較高的生物利用度，相對可減緩對胃腸道刺激，且吸收率不受胃酸減少及食物成分的影響。作為目前行之有效的缺鐵性貧血補鐵劑[9]，多糖鐵復合物在應用于靜脈補鐵方面取得了較大的發展[9]。

常見的多糖鐵復合物的制備方法有氯化鐵共熱合成及硫酸鐵銨化學合成等[10,11]，制得植物多糖類鐵復合物一般為棕黑色粉末，易溶于水、無臭無味且不溶于無水甲醇、乙醇及乙醚等有機溶劑[12]。本文是基于前人對多種植物多糖鐵復合物的合成工藝優化[13-17]，進而改良合成火棘多糖鐵復合物。利用紫外分光光度計檢測多糖鐵復合物中鐵含量的原理[18]，結合其他植物多糖鐵中鐵含量的特定檢測條件[19,20]，優化得到火棘多糖鐵復合物中鐵含量檢測的最優條件。此方法可應用于補鐵劑的制備與檢測，同時也可推廣應用于其它植物多糖鐵復合物的含量測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

火棘果：2016年10月下旬采集于湖北省恩施來鳳地區，經華中科技大學植物學博士楊悅鑒定為全緣火棘Pyracanthaatalantioides(Hance) Stapf的果實。FeCl3、鄰菲啰啉、抗壞血酸、無水乙醇及氫氧化鈉均為分析純，實驗用水為自制去離子水；UV-5900PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；BS系列分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；SB5200DTS雙頻超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；HSJ-6系列恒溫水浴攪拌器，江蘇金壇市科析儀器有限公司；HH-S1數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫療儀器廠；XH-C漩渦混合器，江蘇金壇市醫療儀器廠；GR21G高速冷凍離心機，日本HATACHI公司；DHG-9070A高速冷凍離心機，日本HATACHI公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPC的合成

稱取一定量已脫色脫蛋白后的PPC凍干粉末，置于錐形瓶中，以去離子水溶解并加入檸檬酸三鈉溶液，控制溶液pH在8.0～9.0之間，在攪拌狀態下交替滴加FeCl3溶液和NaOH溶液，直到溶液中出現的紅棕色沉淀不再溶解為止。70 ℃水浴1.5 h。待溶液冷卻至常溫后，在15 000 rpm的轉速下離心15 min，將離心后的紅棕色上清液轉移至2倍體積的無水乙醇中，醇沉過夜。醇沉后的溶液再次離心，取沉淀用無水乙醇洗滌兩次，15 000 rpm離心10 min，將離心后的沉淀冷凍干燥，保存備用，即為PPC凍干粉。

1.2.2 鐵含量的測定

取凍干PPC粉末0.05 g，以去離子水溶解并定容至100 mL，即為待測樣品溶液。取1.0 mL加入抗壞血酸溶液和鄰菲啰啉溶液，去離子水定容至50 mL，搖勻水浴一定時間后作紫外全波段掃描并確定于510 nm處測吸光度。

1.2.3 單因素實驗

考察了反應時間(1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h)、抗壞血酸濃度(2%、4%、6%、8%、10%、12%)和用量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)、鄰菲啰啉溶液的濃度(0.05% 、0.10% 、0.15% 、0.20%、0.25%)和用量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL)以及水浴溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對PPC中鐵含量檢測的影響。

1.2.4 響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，運用響應面軟件中Box-Behnken設計原則，選擇反應時間(A)，水浴溫度(B)和10%抗壞血酸溶液的用量(C)這三個顯著因素進一步優化，以吸光度值作為響應值。設計如下表1所示。

表1 Box-Behnken 設計因素水平及編碼值

1.2.5 方法學驗證

經過響應面優化得到PPC中鐵含量檢測的最優條件后，進一步對該方法進行方法學驗證，即考察其重復性、重現性、穩定性及回收率等。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

圖1 反應時間(A)、鄰菲啰啉用量(B)、抗壞血酸用量(C)、鄰菲啰啉濃度(D)、抗壞血酸濃度(E)及水浴溫度(F)對火棘多糖鐵Ⅲ復合物中鐵含量的測定的影響Fig.1 The influence of reaction time(A),the dosage of O-phenanthroline (B) and ascorbic acid(C),O-phenanthroline concentration(D),ascorbic acid concentration(E)and incubation temperature (F) on the determination of iron content from PPC

如圖1(A)所示，當反應時間小于2.0 h時，隨著時間延長，吸光度先急劇上升再漸趨平緩，至2.0 h時吸光度最大。因為鄰菲啰啉不能和Fe3+直接絡合或與Fe3+形成的配合物穩定性差，說明此過程中抗壞血酸正不斷將Fe3+還原為Fe2+，Fe2+與鄰菲啰啉發生直接絡合，反應時間接近2.0 h時，Fe3+全部被還原為Fe2+，吸光度達到極值。隨反應時間繼續延長，抗壞血酸在還原Fe3+時會使溶液酸性增強，一定程度上部分破壞鄰菲啰啉與Fe2+的絡合物，使吸光度值逐漸減小。由此可知，鄰菲啰啉檢測PPC中鐵含量的最佳反應時間為2.0 h。由圖1(B)可知，隨著鄰菲啰啉溶液用量增加，吸光度先增加并于添加量3.0 mL時達到極值，后趨于平緩，說明鄰菲啰啉用量達3.0 mL時，已足夠與體系中Fe2+完全反應。繼續增加其用量吸光度無明顯變化，故確定鄰菲啰啉溶液的最佳用量為3.0 mL。由圖1(C)可知，當抗壞血酸溶液的用量增加至1.0 mL期間，吸光度先增至極值，說明1.0 mL抗壞血酸已基本將體系中Fe3+完全還原為Fe2+，繼續增加用量，體系酸性增強且體系含水量增加，反而破壞了絡合物的穩定，因此抗壞血酸溶液用量取1.0 mL最適。同理，由圖1(D)可知，隨著鄰菲啰啉溶液濃度增加，吸光度先升后漸趨平緩，鄰菲啰啉為0.1%時吸光度達到極值，說明此時體系中已經有足量的鄰菲啰啉可與Fe2+充分反應，選此濃度較為合適。由圖1(E)可知，隨抗壞血酸溶液濃度增加，吸光度先急劇上升，于10%時達到極值，而后趨于平緩。說明一定量10%抗壞血酸已足夠將PPC中的Fe3+還原成Fe2+，繼續增加用量已無現實意義，故抗壞血酸溶液濃度10%最佳。由圖1(F)可知，隨著水浴溫度升高，吸光度總體呈先升后降趨勢。說明一定范圍內升高溫度有助于加快進行，但溫度過高易使絡合物分解，故選40 ℃較適。

2.2 響應面優化實驗

在單因素實驗基礎上，確定10%抗壞血酸、3.0 mL 0.1%鄰菲啰啉溶液前提下，進一步以響應面Box-Behnken設計優化了反應時間、水浴溫度和10%抗壞血酸溶液用量3個顯著因素對含量檢測的影響，具體如表2所示。

優化實驗完成后，以Design Expert8.06軟件對結果進行二次多項式擬合，得到回歸方程：Y=0.43+0.006 25A+0.023B+0.013C-0.003AB-0.002AC+0.005 75BC-0.003 375A2-0.068B2-0.023C2。對其進行方差與顯著性分析，結果如下表3所示。

表2 響應面實驗設計與結果

表3 方差分析

注：*表示差異性顯著 (0.01

Note：*indicated significant difference,0.01

圖2 火棘多糖鐵Ⅲ復合物中鐵含量測定響應面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of iron content from PPC注：A.水浴溫度與反應時間；B.抗壞血酸用量與反應時間；C.抗壞血酸用量與水浴溫度。Note:A Reaction time and incubation temperature,B Reaction time and ascorbic acid dosage,C Incubation temperature and ascorbic acid dosage

由圖2結合表3分析可知，水浴溫度與反應時間交互作用較顯著，吸光度隨溫度升高先增后減，在45 ℃左右達到極值，水浴溫度對結果的影響比反應時間更為顯著。反應時間與抗壞血酸溶液用量交互作用不顯著，相對而言，水浴溫度與抗壞血酸溶液用量交互作用最顯著。

通過軟件(Design Expert8.0.6)分析得到檢測PPC中鐵含量的最佳條件是反應時間為2.01 h，水浴溫度為44.4 ℃，10%抗壞血酸溶液用量為1.5 mL，在此條件下測得吸光度值應為0.464。為了驗證該響應面結果的可行性，對所得最佳條件進行了優化和驗證實驗。在反應時間2.0 h，水浴溫度45 ℃，抗壞血酸溶液用量1.5 mL條件下進行了5組平行試驗，平均值為0.449，相對標準偏差3.23%，在誤差允許范圍內，說明該響應面優化出的結果比較可靠。

2.3 測定方法評價

2.3.1 標準曲線關系考察

配制不同濃度的PPC溶液(0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mg/mL)置于容量瓶中，按優化得到的最佳檢測條件測定其中鐵的含量。以吸光度為縱坐標，PPC溶液濃度為橫坐標。得出標準曲線的回歸方程為Y=0.728X+ 0.015 4 (R2=0.999 5)，在濃度0.30～0.70 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.2 重復性實驗

按最佳檢測條件，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品兩份。由同一實驗操作人員在510 nm波長下平行測定5組數據，計算標準偏差和相對標準偏差。結果如表4。

分析可知，兩份樣品測出的吸光度值的標準偏差分別為0.001和0.002，相對標準偏差分別是0.64%和0.37%，重復性良好。

表4 重復性實驗

2.3.3 重現性實驗

同上，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品兩份。在不同實驗室環境下，由不同的實驗操作人員在510 nm波長下平行測定5組數據，計算標準偏差和相對標準偏差。結果如下表5。

分析可知，兩份樣品測出的吸光度值得標準偏差為0.002 8和0.003 2，相對標準偏差為1.27%和0.59%，重現性良好。

2.3.4 穩定性實驗

同上，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品兩份。待反應完全后，每隔10分鐘取樣品測吸光度，連續測6次，計算標準偏差和相對標準偏差。結果如表6。

表5 重現性實驗

表6 穩定性實驗

由表中數據可知，兩份樣品測出的吸光度值的標準偏差分別為0.001和0.003，相對標準偏差分別為0.51%和0.59%，說明此樣品在1.0 h內測定吸光度較穩定。

2.3.5 回收率實驗

同上，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品5份，每份1 mL，分別加入0.20 g鐵標準品，同上操作，反應完全后在510 nm波長測定吸光度并計算總鐵含量。計算回收率和相對標準方差，結果如表7。經分析可知，此方法的相對標準偏差為0.320%，回收率可達99.93%。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，通過響應面軟件優化建立火棘多糖鐵復合物中鐵含量檢測條件。結果表明，最佳檢測條件為：1.0 mL適宜濃度的PPC溶液，加1.5 mL 10%抗壞血酸溶液以及3.0 mL 0.1%的鄰菲啰啉溶液后，定容至50 mL并于45 ℃水浴2.0 h，反應完全后以冰水快速冷卻，于510 nm測定吸光度值。此方法的重復性和重現性良好，且在1.0 h內檢測穩定，回收率高達99.93%。測定的體系中，雖然抗壞血酸溶酸性較大，對測定吸光度存在一定影響，但因加完試劑后定容稀釋處理，基本可忽略pH對檢測的影響。此方法操作簡單，結果可靠，可推廣至其他多糖鐵復合物中鐵含量的測定。

表7 回收率實驗(n=5)