不同貯藏條件對五味子質量的影響

陳舒妤，石婧婧，鄒立思，劉訓紅*，唐仁茂，馬繼梅，嚴 穎，趙 慧

1南京中醫藥大學藥學院，南京 210023；2江蘇蘇中藥業集團股份有限公司，泰州 225500

五味子為大宗常用中藥材，系木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心的功效，用于久嗽虛喘，自汗盜汗，內熱消渴，心悸失眠等癥[1]。現代研究表明，五味子主要含有木脂素、有機酸、揮發油等化學成分，具有降酶保肝、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等作用[2-4]。中藥療效的發揮是多種成分綜合作用的結果，針對五味子多元活性成分的特點，建立多元活性成分同時測定的方法，對探討多指標成分的綜合評價體系具有實用性和有效性。

藥材的貯藏是中藥材品質形成的重要環節，有效的貯藏技術可以減少貯藏過程中由于自身特點及貯藏環境因素對中藥材質量產生的不良影響，確保臨床用藥的療效。一般研究認為藥材貯藏造成質量下降的關鍵因素是藥材含水量、貯藏濕度、溫度和時間，尚少見對包裝材料的研究。目前，關于五味子藥材的品質評價及儲藏研究，主要集中于木脂素和有機酸類成分的分析，多以某一類成分中的一種或多種化合物為評價指標，尚少見對上述多元指標成分同時測定的研究報道。其分析方法有高效液相色譜法(HPLC)[5]、超高效液相色譜法(UPLC)[6]、液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)[7]等。HPLC難以解決組分共流出現象[8]，LC-MS 技術具有靈敏度高、選擇性強、分析速度快的優點，更適于中藥復雜體系的分離分析。其中，在四級桿-線性離子阱(QTRAP)系統下，MS/MS譜的靈敏度較標準三重四級桿高出數十倍至數百倍，則可以得到更豐富的MS/MS 數據[9]。本實驗基于超快速液相色譜-串聯四級桿/線性離子阱質譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)技術，同時測定五味子中木脂素及有機酸共15種指標成分的含量，并結合灰色關聯度分析[10]和TOPSIS法對不同貯藏條件(不同包裝材料，不同貯藏溫度)五味子藥材進行比較分析與綜合評價，旨在為五味子適宜儲藏條件的優選提供基礎資料，同時為五味子藥材內在質量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SIL-20A XR超快速液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB QTRAP 4500 型三重四級桿線性離子阱質譜儀(美國AB SCIEX公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(德國賽多利斯公司，1/100萬)；KQ-500B超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz)；湘儀H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥與試劑

五味子甲素(批號：110764-200408)、五味子乙素(批號：110765-200407)、五味子醇甲(批號：110857-200709)、五味子酯甲(批號：111529-200503)、L-蘋果酸(批號：190014-201302)購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；五味子丙素(批號：lw16051601)、五味子醇乙(批號：lw16071904)、五味子酯乙(批號：lw16100801)、戈米辛：D(批號：lw16032405)、戈米辛：J(批號：lw16092404)、當歸酰基戈米辛：H(批號：lw16072204)、五味子酚(批號：lw16012701)、奎寧酸(批號：lw16071201)、酒石酸(批號：lw15122605)購自南京良緯生物科技有限公司，純度均大于98%；原兒茶酸(批號：YECS20140411)購自南京春秋生物工程有限公司，純度大于98%；乙腈、甲酸為色譜純，德國Merck公司產品；甲醇(批號：143135)為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.3 材料

五味子藥材由蘇中藥業集合股份有限公司提供，產地：吉林，批號：17032802，規格統貨，經南京中醫藥大學劉訓紅教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，留樣憑證存放于南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室。樣品由作者自己按不同貯藏條件(不同包裝材料，不同貯藏溫度)每份500 g貯藏半年后取出，樣品信息見表1。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液制備

精密稱取奎寧酸、酒石酸、L-蘋果酸、原兒茶酸、五味子醇甲、戈米辛 D 、戈米辛 J、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛 H 、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素 、五味子乙素 、五味子丙素、五味子酯甲的對照品適量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解制成質量濃度分別為950.00、998.00、1 570.00、1 110.00、970.00、920.00、846.00、972.00、982.00、960.00、996.00、960.00、978.00、978.00、1 024.00 μg/mL的對照品儲備液，供分析用。取各對照品儲備液適量，加甲醇定容至10 mL制成混合對照品溶液，并逐級稀釋，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，供分析用。

表1 不同貯藏條件樣品信息

注：S1～S8：貯藏于陰涼庫中考察不同包裝材料樣品；S1，S9～S12：以麻袋為包裝材料考察不同貯藏溫度樣品。

Note:S1-S8：All stored in cool warehouse to research different package materials;S1,S9-S12：All stored in sacks to research different temperature.

2.2 供試品溶液制備

精密稱定樣品粉末0.5 g，精密量取加入甲醇20 mL，密閉，稱重，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，放置冷卻，再次稱重，用甲醇補足質量損失，過濾，濾液(12 000 rpm)離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液用甲醇稀釋25倍即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：SynergiTMHydro-RP 100? 柱(100 mm × 2.0 mm,2.5 μm)；流動相：A為 0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min、30%～52% B，4～8 min、52%～75% B，8～11 min、75%～90% B，11～15 min、90%～30% B，15～17.10 min、30%～30% B；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量1.0 μL。

2.4 質譜條件

離子化方式：電噴霧離子源(ESI)；多反應監測離子掃描模式(MRM)檢測；氣簾氣流速35 L/min；霧化氣流速55 L/min；輔助氣流速55 L/min；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓：正離子模式下5 500 V，負離子模式下-4 500 V。15種成分的質譜具體參數見表2。

表2 15種成分的質譜分析參數

2.5 分析方法

采用SynergiTMHydro-RP 100?色譜柱對色譜分離條件進行優化，按照優化的條件進行UFLC-QTRAP-MS/MS分析，并做方法學考察，用外標法計算各樣品中15種功效成分的含量。根據含量測定結果，用灰色關聯度及TOPSIS分析對不同貯藏條件五味子藥材進行綜合評價。

3 實驗結果

3.1 提取條件優化

實驗分別考察了提取溶劑(50%、70%、100%甲醇)、料液比(1:20、1:40、1:60)及提取時間(20、40、60 min)。結果表明，以100%甲醇作為提取溶劑，料液比1:40，超聲40 min時相對峰面積較大。

3.2 色譜、質譜條件優化

實驗考察了不同流動相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水)及梯度洗脫條件對樣品中各峰色譜峰形及分離度的影響。結果顯示，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時，峰形更好且有良好的分離效果。因此選擇0.1%甲酸水-乙腈作為流動相梯度洗脫。實驗同時選用正、負離子模式測定15種目標成分的含量，其中4種有機酸(L-蘋果酸、酒石酸、原兒茶酸、奎寧酸)在負離子模式下有較強的離子響應和更好的峰形，其他成分在正離子模式下有較強的離子響應和更好的峰形。

3.3 方法學考察

3.3.1 標準曲線、檢測限和定量限

精密吸取“2.1”項下一系列濃度的混合對照品標準溶液，按“2.3”項和“2.4”項條件進樣分析，以對照品的峰面積(Y)對相應的濃度(X)進行線性回歸，得到回歸方程、相關系數和線性范圍；以各化合物的3倍信噪比(S/N)相對應的濃度為檢測限(LOD)，以各化合物的10倍信噪比(S/N)相對應的濃度為定量限(LOQ)。結果見表3，圖1。

表3 15種成分的線性方程、相關系數、檢測限和定量限

3.3.2 精密度、重復性、穩定性實驗

取“2.1”項下制備的混合對照溶液，進樣量為1 μL，連續自動進樣6次，記錄15種目標成分峰面積并計算RSD；取S1樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，吸取1 μL進樣，重復測定6次，計算各目標成分含量的RSD；取S1樣品，按“2.2”項下方法供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測定，記錄15種目標成分峰面積并計算RSD，結果見表4。

3.3 .3加樣回收率實驗

精密稱取9份已知含量的S1樣品各0.25 g，置于錐形瓶中，平均分為三組，分別加入3個不同水平(80 %、100 %、120 %)的各對照品溶液適量后，震蕩均勻，按“2.2”項下方法制備加樣回收率供試品溶液，分別進行測定，結果見表5。

圖1 15種成分的MRM圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms of fifteen components注：1.奎寧酸；2.酒石酸；3.L-蘋果酸；4.原兒茶酸； 5.五味子醇甲；6.戈米辛D；7.戈米辛J；8.五味子醇乙；9.當歸酰基戈米辛H；10.五味子酯乙；11.五味子酚；12.五味子甲素 13.五味子乙素；14.五味子丙素；15.五味子酯甲Note:1.Quinic acid；2.D(-)-Tartaric acid；3.(S)-malic acid；4.Protocatechuic acid；5.Schisandrin；6.Gomisin D；7.Gomisin J；8.Schisandrol B；9.Angeloylgomisin H；10.Schizantherin B；11.Schisanhenol； 12.Deoxyschizandrin；13.γ-schisandrin；14.Schizandrin C；15.Schisantherin

表45種目標成分的精密度、重復性、穩定性(%，n=6)

Table 4 Precisions,repeatabilities and stabilities of fifteen components(%，n=6)

化合物Compounds精密度RSDPrecision RSD重復性RSDRepeatability RSD穩定性RSDStability RSD12.43.51.123.12.12.331.83.21.242.32.53.353.10.73.161.11.51.272.03.03.082.62.40.892.51.63.1101.01.32.3112.64.91.5120.91.61.3131.90.51.1142.23.82.5150.72.21.0

表5 15種目標成分加樣回收率(%，n=3)

續表5 (Continued Tab.5)

化合物Compounds樣品含量Content in sample(μg)加入量Standard added(μg)測得值Measured加樣回收率Recovery平均回收率±RSDAverage recovery ± RSDGomisin D32.44432.2006496.9632.44438.6407096.33戈米辛 J111.06588.83019998.6398.31±0.66Gomisin J111.065110.82622098.59111.065133.66824297.70五味子醇乙631.419505.440113299.0599.01±0.43Schisandrol B631.419631.800125698.85631.419758.160138399.13當歸酰基戈米辛 H272.034218.00449099.8499.59±0.5Angeloylgomisin H272.034272.01454299.24272.034327.00659899.68五味子酯乙217.628173.76039099.0299.11±0.55Schizantherin B217.628217.92043398.98217.628261.12047799.33五味子酚68.87954.78012398.1997.92±1.95Schisanhenol68.87968.72413798.6368.87982.66814996.92五味子甲素166.465133.44029797.8398.71±0.82Deoxyschizandrin166.465166.08033198.86166.465199.68036599.42五味子乙素756.206604.404135899.6399.69±0.18γ-schisandrin756.206755.994151099.75756.206907.584166199.69五味子丙素162.472130.07429198.5798.15±0.63Schizandrin C162.472162.34832197.64162.472194.62235498.24五味子酯甲743.694595.149133899.8999.92±0.05Schisantherin743.694743.936148799.89743.694892.723163699.97

3.4 樣品含量測定

取五味子供試品溶液，按照上述色譜-質譜條件測定，根據相應線性關系計算供試樣品中15種成分的含量，測定結果見表6。

表6 五味子中15成分含量(μg / g,n = 3)

續表6(Continued Tab.6)

Serial No.108141312155116793241S5487.422936.48636.242836.60638.232017.586102.68284.6684.60406.511148.622407.116.539738.314314.82S6461.452906.51623.252776.67641.231957.656032.76254.69114.86483.421128.652786.6610.499208.955103.88S7473.432467.04566.322407.11539.3515.385783.06255.6978.61318.62961.852357.176.687341.194045.15S8456.452856.57575.312646.82597.2823.676292.45232.7278.01466.441078.712397.125.977980.424115.06S9798.882895.95653.092766.13656.0839.345951.67276.61117.84372.481158.383285.406.389896.156540.84S10738.972646.30572.202616.34590.1798.865712.00233.6764.01485.321028.562616.348.616620.733854.60S11500.302466.55545.242446.57541.2462.215592.17227.6899.26288.60995.612846.0211.084903.145522.27S12384.542307.23535.362297.24551.3439.755353.58227.7368.22269.68811.032616.868.954824.214874.15

3.5 灰色關聯度法和TOPSIS法

按照文獻[10,11]進行數據處理，各樣品的關聯度ri和相對接近度Ci及其排序(見表7)。

表7 評價對象的ri和Ci值及其排序

注：差異是指各評價對象與最優評價對象的差距，差異=(關聯度或Ci最大值-各評價對象關聯度或Ci值)/最大值×100%。

Note:Differences of rior Ciwere the distance between each sample and the best sample,difference=(MAX rior MAX Ci- rior Ci)/MAX×100%.

3.6 灰色關聯度分析與TOPSIS分析比較

根據表7，對比2個排序，可知灰色關聯度分析和TOPSIS 分析結果基本一致，均以S4樣品綜合質量最優，其次是S3、S1樣品，分別為以聚乙烯密封袋、陶瓷缸、麻袋為包裝材料貯藏于陰涼庫的樣品。以麻袋為包裝材料考察不同貯藏溫度的樣品，貯藏于常溫及陰涼庫的樣品綜合質量較好，其余樣品綜合質量較差，尤其是貯藏于超低溫的樣品S12，可見不是貯藏溫度越低越好。ri與Ci的最大差異分別達到57.5 %與81.3 %，因此TOPSIS 分析能夠更好的區分樣品的質量優劣。

4 結論

中藥材的干燥儲藏是最常見的一種藥材保存方法，但不適宜的貯存條件會引起霉變、蟲蛀及有效成分的含量變化，降低藥材的質量[5,12]。有效的貯藏技術可以減少不良因素對藥材質量的影響，確保臨床療效。針對目前五味子貯藏研究尚少、實際貯藏尚無規范標準的情況，本實驗以15種功效成分為考察指標，探討不同貯藏溫度(常溫、陰涼庫、冷庫、冰柜、低溫柜)及不同包裝材料(麻袋、塑料編織袋、陶瓷缸、聚乙烯密封袋、玻璃缸、牛皮紙袋、鋁塑袋、布袋)對五味子藥材質量的影響。含量測定結果表明，所分析的五味子樣品中，五味子醇甲含量均大于0.04%，符合《中國藥典》2015版一部的標準；木脂素類成分以五味子醇甲和五味子醇乙的含量較高，有機酸類成分以原兒茶酸和奎寧酸的含量較高。由于不同貯藏條件五味子樣品中木脂素類及有機酸類15種目標成分的含量不一，難以直觀判斷，因而采用灰色關聯度分析及TOPSIS分析進行綜合評價，分析結果顯示，S4的綜合質量最好。聚乙烯密封袋具有較好的密封性,能有效防止潮濕空氣的滲入,在貯存過程中減少外界環境的影響，這與如今大多數中藥房五味子藥材的包裝材料一致。貯藏于陰涼庫的樣品S1、S3的綜合質量也較好，顯示麻袋和陶瓷缸也是較好的包裝材料，麻袋具有良好的保溫性和吸潮性，而陶瓷缸的防潮性和隔熱性良好,一般情況下外界熱空氣和潮濕空氣不易滲透進入。麻袋較陶瓷缸更為輕便，在實際大生產中可以考慮使用。貯藏于陰涼庫的樣品S1～S6綜合質量較好，說明陰涼庫是貯藏五味子較為適宜的溫度。

本實驗采用超快速液相色譜-串聯四級桿/線性離子阱質譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)同時測定五味子中木脂素類及有機酸類共15種指標成分的含量，并結合灰色關聯度分析和TOPSIS法對不同貯藏條件五味子藥材進行比較分析與綜合評價。所建立的方法準確、可靠，可用于五味子藥材內在質量的綜合評價，本研究可為五味子適宜儲藏條件的優選提供基礎資料。