綠蘿內生真菌中甲醛降解菌的篩選和鑒定

廉佳佩，段喬健，張 云，焦樂樂，李曉軍，延文星，張弘弛

(山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009)

甲醛可以危害到人體的很多方面：其一，甲醛可以直接通過外部皮膚接觸引發病癥，嚴重時可能導致皮膚壞死。其二，甲醛濃度超標一般會引起呼吸道疾病，這是因為甲醛能與人體呼吸道蛋白質結合，從而對人體呼吸道造成傷害。目前，甲醛污染的問題引起了國內外諸多專家學者的重視，生物降解的方法在近年來引起了國內外很多學者的關注，生物法降解甲醛具有高效低成本的優點，而且方法簡單、更加環保[1-2]。雖然生物法降解甲醛引起了人們的關注，但是如今對于降解甲醛的特殊微生物菌種的研究相對來說還是比較少的，綠蘿作為生活中常見的具有凈化甲醛作用的植物，被稱為“生命之花”，從其內生真菌中分離出對甲醛具有降解作用的真菌對于解決甲醛污染問題，凈化生活環境有重要的作用。

1 材料和儀器

1.1 實驗材料

樣品選為市面銷售的普通綠蘿，并將其放置于甲醛濃度高于國家甲醛標準0.1 mg/L的新裝修室內培養15 d作為實驗樣品。

1.2 培養基成分

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

改良察式選擇培養基：硫酸銨1.00 g，磷酸氫二鉀2.16 g，硫酸鎂0.10 g，磷酸二氫鉀0.85 g，硫酸鎂0.05 g，氯化鈣0.03 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.0。

察氏培養基：葡萄糖30 g，硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

1.3 儀器設備及試劑

DHP-600電熱恒溫培養箱(金壇市國旺實驗儀器廠)，LS-7SHD全自動數顯立式高壓蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫療設備有限公司)，SW-CJ-2F超凈工作臺(昆明普康儀器儀表有限公司)，XMA-600鼓風干燥箱(余姚市亞泰儀表有限公司)，GW-D恒溫搖床(北京市六一儀器廠)，UV-3200S紫外/可見分光光度計(上海美國譜達儀器有限公司)，SK210digitall生物顯微鏡(麥克奧迪事業集團有限公司)；乙酰丙酮溶液、37%甲醛溶液、75%乙醇、3%次氯酸鈉溶液、無菌水、蒸餾水等。

2 方法

2.1 樣品的處理

在綠蘿盆栽樣品上剪取正常生長的綠蘿葉片，在流水下沖洗葉片表面污物后再用無菌水沖洗干凈，然后使其自然風干。風干后對葉面表面進行消毒處理，-步驟如下：先用75%的乙醇溶液浸泡15～30 s，然后用3%的次氯酸鈉溶液浸泡10 s，最后再于75%的乙醇溶液中浸泡10 s后用無菌水沖洗2～3次。

2.2 菌種富集培養

在無菌條件下將葉片剪碎后，放置于已滅菌的研缽中研磨成漿，取5 g綠蘿葉片漿液，接種于100 mL的PDA液體培養基中進行富集培養，于28 ℃、150 r/min的條件下的恒溫搖床中培養10 d。

2.3 甲醛降解菌的篩選

2.3.1 培養基的選擇及甲醛溶液的處理

改良察氏選擇培養基為此步驟所用的培養基，高壓蒸汽滅菌后，待培養基凝固的同時，在無菌條件下進行甲醛溶液的配制，分別配制質量濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200 mg/L的甲醛溶液。

2.3.2 唯一碳源甲醛的添加

待培養基徹底冷卻凝固后，吸取10 μL不同濃度的甲醛溶液滴在固體培養基中央，用三角涂布棒將甲醛溶液推向培養皿四周使其均勻分布，每個濃度涂布兩個培養基以便作為重復試驗，并在培養皿上貼上標簽，標示出甲醛溶液的濃度。同時以不添加甲醛而添加無菌水的培養基作為對照。待涂布的甲醛溶液在培養基上完全滲下后，用移液管吸取富集培養液的上清液0.5 mL于固體培養基上，同樣用三角涂布棒涂布均勻，在30 ℃培養5 d。

2.3.3 甲醛降解菌的分離純化

將培養5 d后的菌種在改良察氏選擇培養基上進行平板劃線操作，在培養基的背面用記號筆標記出劃線的四個區域，在第四區域得到所需菌落。繼續在改良察氏選擇培養基上進行多次的純種劃線操作，直至得到純的單株菌落。

2.3.4 甲醛降解性能的鑒定

將分離純化得到的單株菌種接種于甲醛質量濃度為90 mg/L的改良察氏選擇液體培養基中，以不加入甲醛而加入無菌水的培養基[3]為對照，在28 ℃、150 r/min的恒溫搖床上培養一周，驗證該菌種對甲醛的降解性。

2.4 甲醛降解菌E.a-03的鑒定

將分離純化出的單株菌落利用點殖法接種于察氏培養基上。在點接菌落時，用接種環挑取少量菌種，輕輕點在固體培養基適宜的三個位置上(成三角形狀分布)。接種菌種后，于28 ℃培養，從3 d后開始觀察其菌落形態并且記錄其外觀變化和色素產生情況；采用插片培養法觀察菌種的菌絲、孢子囊及孢子等形態[4-5]。將分離純化得到的對甲醛有降解作用的綠蘿內生真菌接種于察氏培養基的試管斜面上培養，待菌落長出后交于測試公司進行分子生物學鑒定，將測序后的ITS序列經Blast比對，在進行該菌種系統發育樹的構建。

2.5 甲醛降解菌E.a-01的生長曲線及甲醛降解曲線的測定

以改良察氏選擇液體培養基為營養培養基，在該培養基中加入濃度為90 mg/L的甲醛溶液作為該菌種可以吸收的唯一碳源，按照10%的接種量[6]用已經滅菌的移液管吸取種子液于150 mL的改良察氏選擇液體培養基中，共接種52瓶培養基。封口前先吸取2 mL清液測其降解前的吸光度值OD0并記錄，封口后在恒溫搖床中28 ℃、150 r/min培養20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200 h時，于每個時間取出3瓶，過濾得到菌絲體于55 ℃烘箱中干燥9 h后，分別在電子天平上稱量菌絲干重并取平均值得到每個生長時間段的平均菌絲干重，記錄數據。

2.6 甲醛降解曲線的測定[7]

取出培養液過濾后得上清液，用移液管吸取2 mL上清液于25 mL的具塞試管中，然后加入2.5 mL的乙酰丙酮溶液后用振蕩器將二者混合均勻后向試管中加入蒸餾水至刻度線，在100 ℃中水浴15 min，待冷卻后于波長414 nm下測量其吸光度，以蒸餾水為參照，測出降解后甲醛的吸光度值OD1。測得降解前后甲醛的吸光度值后，利用公式：降解率(%)=(1-OD1/OD0)×100計算出培養過程中不同時間段甲醛的降解率并記錄數據。

3 結果與分析

3.1 降解菌鑒定結果

圖1 E.a-01菌落特征和顯微結構

Fig.1 Colony characteristics and microstructure of E.a-01

圖2 E.a-01的系統發育樹分析

通過對綠蘿內生真菌的篩選，經過多次分離純化得到一株對甲醛具有降解性能的菌株E.a-01。該株菌種的菌絲生長較為疏松，菌絲大多呈毛絮狀生長，培養3 d時菌落表面呈白色；5 d左右逐漸由色素積累，菌落開始呈現淡青色；培養至7 d時，菌落直徑達到38～50 mm，菌落表面顏色有明顯分別，中間顏色較深呈現黃褐色，外部顏色為青綠色，邊緣菌絲呈現白色；長至12 d菌落鋪滿整個培養皿，從背面觀察菌落呈現白綠色(圖1)。經過對該菌株的玻片進行顯微觀察，發現E.a-01的菌絲較為發達，分枝多且明顯，為有隔菌絲，孢子囊呈球形，孢子較分散(圖1)。

經過對該菌株的測序分析，菌株 E.a-01的ITS序列長度為591bp，菌株E.a-01的系統發育樹如圖2。BLAST比對結果表明，E.a-01的rRNA-ITS序列和Penicilliumdipodomyicola的序列相似。在系統發育樹中，E.a-01與Penicilliumdipodomyicola屬于同一分枝。再結合該菌株的形態學特征及其顯微結構，可將E.a-01鑒定為青霉Penicilliumdipodomyicola。

3.2 綠蘿內生真菌 E.a-01的生長曲線和甲醛降解曲線

圖3 內生真菌 E.a-01的生長曲線與甲醛降解率曲線

從圖3中我們可以明顯的看到，內生真菌 E.a-01的生長曲線與其甲醛降解率曲線在培養時間20～200 h的生長趨勢基本上一致。在20～70 h期間，該菌株的生長狀況和其對甲醛的降解率均處于較低的狀態，且增長幅度不明顯，培養50 h后細菌干重僅增加0.879 g，而對于甲醛的降解率僅由4.7%增長到14.7%。可以說細胞在此期間的增長處于延滯狀態；當菌體培養到70 h之后，生長曲線和甲醛降解率曲線均有明顯的變化，在70～100 h期間，菌體開始大量生長，而其對于甲醛的降解率也開始逐步的上升，說明在此期間菌種開始逐漸的適應生長條件；當培養菌體至100 h后，菌體開始出現對數增長的情況，在100～160 h期間，菌體干重由1.694 g上升至2.870 g，甲醛降解率也由27.8%上升至84.7%，此時菌體對于甲醛的降解率達到最大。在培養160 h之后，細胞開始逐漸衰亡，菌體干重下降較快，而該菌種對于甲醛的降解率呈現直線下降的趨勢，在培養至200 h時，菌絲干重下降至1.951 g，而該菌種對于甲醛的降解率則直接下降至41.7%，接近于最高甲醛降解率的一半。說明在培養至160 h之后，營養物質的消耗以及菌體本身代謝的減緩，使得細胞開始自溶逐漸走向死亡。綜上所述，綠蘿內生真菌 E.a-01的培養時間處于140～160 h時，菌體生長最為茂盛，處于菌體的對數生長期。

4 討論

將內生真菌E.a-01與其他高效甲醛降解菌相比，該菌的甲醛耐受力以及對于甲醛的降解效率與高效甲醛降解菌還有很大的差距。在后續的試驗工作中，期望可以結合基因育種的方法改良該菌株的基因，進而可以提高其對甲醛的耐受力并且進一步提高該菌株對于甲醛的降解效率，希望可以將內生真菌發展成為較為高效的甲醛降解菌，為當今化工行業、家裝污染以及廢水處理提供更為高效，更為簡便，更為環保的方法。