長鏈非編碼RNA MAGI 2-AS 3在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義△

李會政，劉琳，崔玲，張穎，劉雙，王玲

大連市友誼醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，遼寧 大連116100

喉癌的發病率在頭頸部惡性腫瘤中居第2位[1]，尤其在中國北方地區高發。罹患喉癌后，患者呼吸、發聲、吞咽等重要生理功能受損，生活質量嚴重下降[2-3]。喉鱗狀細胞癌的發生發展及侵襲轉移的基因網絡調控機制一直是該病防治研究的關鍵。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）屬于一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，雖然不具有編碼蛋白質的潛能，但可在基因網絡調控中發揮重要的生物學功能，如參與多種生物學過程和信號通路的調控等[4-7]。近期的研究結果表明，lncRNA與喉鱗狀細胞癌發生發展密切相關[8-11]。有學者利用芯片檢測發現，MAGI2反義鏈RNA3（MAGI2-antisense strand 3，MAGI2-AS3）在喉鱗狀細胞癌中的表達呈下調趨勢[12-13]，提示其可能是喉鱗狀細胞癌中異常下調的抑癌基因。然而，MAGI2-AS3在喉鱗狀細胞癌中的表達與臨床特征的關系以及其細胞生物學功能尚不明確。

本研究檢測了喉鱗狀細胞癌組織及配對喉正常黏膜組織MAGI2-AS3的表達水平，并進一步分析MAGI2-AS3表達水平與喉鱗狀細胞癌臨床分期、病理類型、組織學分級及淋巴結轉移情況等臨床特征的關系，并在體外喉鱗狀細胞癌細胞中過表達MAGI2-AS3后觀察細胞遷移、侵襲惡性表型的變化以及上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）標志物的改變，明確MAGI2-AS3在喉鱗狀細胞癌發生、發展過程中的潛在生物學功能。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月至2015年12月大連市友誼醫院初診為喉鱗狀細胞癌患者80例。患者入院前未行放化療及生物治療，經B超、計算機體層攝影（CT）等檢查排除其他部位原發腫瘤；無乙肝等感染病病史及家族遺傳性疾病病史。腫瘤組織均經過病理檢查確診為喉鱗狀細胞癌。80例患者中，男73例，女7例；年齡為39～78歲，中位年齡為60.8歲；有吸煙史77例，無吸煙史3例；臨床分型：聲門上型36例，聲門型38例，聲門下型6例；病理類型：高、中分化鱗癌62例，低分化鱗癌18例；臨床分期：T1期23例，T2期23例，T3期26例，T4期8例；有頸部淋巴結轉移20例，無頸部淋巴結轉移60例。選取患者的腫瘤組織及相應癌旁正常黏膜組織用于后續試驗。本研究經大連市友誼醫院醫學倫理委員會批準備案。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑為美國賽默飛世爾公司產品，逆轉錄試劑盒HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis和SYBR Green法定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產品，實時熒光定量PCR（real-time quantitative-PCR，qRT-PCR）引物由華大基因科技有限公司合成。7500 Fast型qRT-PCR儀為美國應用生物系統（Applied Biosystems）公司產品。

1.3 RNA提取及逆轉錄

組織總RNA用Trizol試劑提取后，經紫外分光光度計檢測濃度及純度合格后凍存備用。cDNA合成采用逆轉錄試劑盒進行，反應體系為20 μl：2×RT Mix10 μl，HiScript?Ⅱ Enzyme Mix 2 μl，隨機引物1 μl，1 μg總RNA，加無RNA酶去離子水至20 μl。反應條件為25℃下5 min，50℃下45 min，85℃下5 min。

1.4 qRT-PCR檢測MAGI 2-AS 3的相對表達量

U6基因為內參，7500 Fast型qRT-PCR儀檢測MAGI2-AS3基因CT值，反應體系為20 μl，按照試劑盒說明書進行操作。qRT-PCR反應條件為95℃下30 s，95℃下10 s,60℃下30 s，以上反應設置為40個循環。擴增反應結束后，設置如下反應條件，建立PCR產物溶解曲線：95℃下15 s；60℃下60 s；60℃開始，每個循環增加0.5℃，直至95℃，最后95℃下反應15 s。MAGI2-AS3定量PCR引物，F：5'-GATGTAGCAAGAGTTGGGAAGA-3'，R：5'-CATGTATTATCGCAGTGGGTTTG-3'。內參基因U6定量PCR引物，U6-F：5'-TCGCTTCGGCAGCACATAT-3'，U6-R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'。采用 2-△△Ct法計算MAGI2-AS3相對表達量，其中△△Ct=腫瘤組織（Ct MAGI2-AS3-CtU6）-癌旁正常黏膜組織（Ct MAGI2-AS3-CtU6）。每個樣品設3個復孔。

1.5 MAGI 2-AS 3過表達載體的建立

以喉鱗狀細胞癌組織cDNA為模板，使用引物MAGI2-AS3-F-NheⅠ ：5'-GCTGGCTAGCATTGCCCTGCGCCCCGAGCGGT-3'和MAGI2-AS3-RXhoⅠ：5'-CGGCCTCGAGGAGAAAATAACAGGATTCATCTCCPCR-3'擴增獲得MAGI2-AS3全長序列，亞克隆至pcDNA3.1陽性載體NheⅠ和XhoⅠ位點之間，獲得MAGI2-AS3過表達載體，載體經DNA測序驗證正確。

1.6 Transwell小室檢測細胞遷移、侵襲能力

選取本科實驗室存儲的喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2。培養條件為5%CO2、37℃飽和濕度培養，培養基為MEM培養基（美國Gibco公司）加入10%胎牛血清（以色列BI公司）。Hep-2細胞轉染過表達MAGI2-AS3載體和空白載體，轉染后第2天，計數 1×105個細胞，用 100 μl無血清 DMEM-F12、MEM培養基重懸，加入Transwell小室上室，下室加入約600 μl完全培養基。37℃下5%CO2孵育48 h后取出小室，棉簽擦去上室細胞，4%多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌1次，結晶紫染色10 min后PBS浸洗，拍照后用醋酸洗滌小室，光密度（optical density，OD）450測吸光度。侵襲實驗在Transwell小室上室平鋪Martrigel膠，其余操作與遷移實驗相同。

1.7 蛋白質印跡（Westernblotting）法檢測蛋白的相對表達量

空載Hep-2細胞和過表達MAGI2-AS3后的Hep-2細胞用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（江蘇碧云天生物技術有限公司）裂解提取總蛋白，按BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司）說明書檢測各樣品蛋白濃度，校正上樣量；沸水浴加熱3～5 min，使蛋白變性，負載緩沖液（loading buffer）混勻后上樣于預制膠（上海翊圣生物科技有限公司），100 V電泳2 h，轉膜后封閉2 h，4℃一抗過夜搖床孵育，二抗孵育 2 h，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）液（美國Advansta公司）浸透后用成像儀檢測并獲取圖像。其中，一抗上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經鈣黏素（N-cadherin）、snail、波形蛋白（vimentin）、內參蛋白GAPDH均購自美國CST公司。

1.8 生物信息學公共數據庫

MAGI2-AS3在頭頸部鱗癌中相對表達數據來源于TCGA數據庫，相應分析圖表生成于GEPIA軟件。MAGI2-AS3表達中位值是根據GEPIA系統中TCGA測序標準化數據計算得出。MAGI2-AS3表達量在中位值以上定義為高表達，中位值以下定義為低表達。

1.9 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件分析數據。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法，由GEPIA軟件自動生成。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MAGI 2-AS 3在喉鱗狀細胞癌組織及正常組織中的表達情況

在檢測的80例喉鱗狀細胞癌和相應癌旁正常黏膜組織中，63例喉鱗狀細胞癌組織的MAGI2-AS3相對表達量低于癌旁正常黏膜組織，17例喉鱗癌組織的MAGI2-AS3相對表達量高于癌旁正常黏膜組織。比較整體MAGI2-AS3相對表達量發現，癌旁正常黏膜組織的MAGI2-AS3相對表達量是喉鱗狀細胞癌組織的（1.504±0.145）倍，差異有統計學意義（t=12.275，P＜0.01）（圖1）。

2.2 不同臨床特征喉鱗狀細胞癌患者的腫瘤組織中MAGI 2--AS3的表達情況

圖1 喉鱗狀細胞癌組織（n=80）與癌旁正常黏膜組織（n=80）中MAGI 2-AS 3的相對表達倍數

依據2-△△Ct方法計算基因相對表達量后結合患者的臨床特征進行分析，結果顯示：不同性別、年齡、臨床分期、分化程度及吸煙情況患者的MAGI2-AS3相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；但T3+T4期、有淋巴轉移患者的MAGI2-AS3相對表達量分別為（0.419±0.253）、（0.303±0.119），均低于T1+T2期、無淋巴結轉移患者的（0.823±0.203）、（0.767±0.339），差異均有統計學意義（t=0.975、2.100，P＜0.05）。（表1）

2.3 過表達MAGI 2-AS 3對Hep- 2細胞遷移、侵襲能力的影響

表1 不同臨床特征的喉鱗狀細胞癌患者腫瘤組織中MAGI 2-AS 3的相對表達量（n=80）

Hep-2細胞過表達MAGI2-AS3后的遷移能力是空載Hep-2細胞的（0.403±0.181）倍，差異有統計學意義（t=4.271，P＜0.01）；Hep-2細胞過表達MAGI2-AS3后的侵襲能力是空載Hep-2細胞的（0.502±0.090）倍，差異有統計學意義（t=77.699，P＜0.01）。（圖2）

2.4 過表達MAGI 2-AS 3對Hep- 2細胞蛋白表達的

圖2 Transwell小室檢測空載Hep- 2細胞（vector）及過表達MAGI 2-AS 3后Hep- 2細胞（OE-MAGI 2-AS 3）的遷移、侵襲能力對比（結晶紫染色，×100）

喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2過表達MAGI2-AS3后，上皮標志物E-cadherin表達水平高于空載Hep-2細胞，間質標志物N-cadherin、snail、vimentin表達水平低于空載Hep-2細胞。（圖3）

2.5 MAGI 2--AS3在頭頸部鱗癌組織中的轉錄水平及與預后的關系

圖3 Western blotting法檢測過表達MAGI 2-AS 3的Hep- 2細胞的EMT標志物表達情況

利用GEPIA軟件上的TCGA數據庫分析MAGI2-AS3在頭頸部鱗癌組織中的相對表達量，結果顯示，在519例頭頸部鱗癌組織中MAGI2-AS3的相對轉錄水平低于44例正常癌旁黏膜組織（P＜0.05）。519例頭頸部鱗癌組織中有隨訪生存信息的患者516例，利用GEPIA軟件中的生存模塊分析顯示，MAGI2-AS3高表達患者的中位生存時間長于低表達患者，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖4）

圖4 TCGA數據庫中頭頸部鱗癌（HNSCC）（n=519）、癌旁正常黏膜（normal）（n=44）中MAGI 2-AS 3相對表達量以及K-M生存曲線（n=516）

3 討論

lncRNA以往被認為是基因轉錄產生的垃圾產物或噪音，但研究表明其具有重要的基因網絡調控功能，如在轉錄沉默、轉錄激活、染色體修飾、核內運輸等過程中都發揮著重要的作用[12]。特別是在腫瘤發生、發展中扮演重要的角色，是目前腫瘤領域的研究熱點。MAGI2-AS3由人基因組7號染色體79452957-79471208區域的DNA序列轉錄產生。Zhang等[13]利用基因芯片檢測發現MAGI2-AS3在喉鱗狀細胞癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織。然而，MAGI2-AS3在喉鱗狀細胞癌中的功能和作用機制尚不明確。本研究采用qRTPCR技術對80例喉鱗狀細胞癌組織及相應癌旁正常黏膜組織中的MAGI2-AS3表達進行驗證，結果顯示，喉鱗狀細胞癌組織中MAGI2-AS3相對表達量低于癌旁正常黏膜組織，提示MAGI2-AS3表達量降低與喉鱗狀細胞癌的發生發展有關。本研究利用GEPIA軟件上的TCGA數據庫分析MAGI2-AS3在頭頸部鱗癌組織中相對表達數據，發現其在519例頭頸部鱗癌組織中的相對轉錄水平低于44例正常癌旁黏膜組織（P＜0.05），這與本研究的檢測結果趨勢一致。

臨床分期、病理類型及是否發生頸部淋巴結轉移是喉鱗狀細胞癌預后評估的重要臨床指標[14-17]。本研究發現聲門上型、聲門型和聲門下型喉鱗狀細胞癌患者的MAGI2-AS3相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。在組織學分化程度中，低分化喉鱗狀細胞癌患者與高、中分化喉鱗狀細胞癌患者的MAGI2-AS3相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，不同年齡及是否有吸煙史的患者MAGI2-AS3相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。值得注意的是：T3+T4期、有淋巴轉移患者的MAGI2-AS3相對表達量均低于T1+T2期、無淋巴結轉移患者（P＜0.05）。腫瘤中表達下調的基因常被認為可能是重要的抑癌基因[18-20]，因此，可以推測MAGI2-AS3在喉鱗狀細胞癌中可能通過調控下游蛋白編碼基因水平抑制喉鱗狀細胞癌惡性表型。本研究在喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2進一步過表達MAGI2-AS3后發現，Hep-2細胞的遷移能力及侵襲能力均受到抑制（P＜0.01）。同時發現過表達MAGI2-AS3后，可明顯改變Hep-2 EMT相關標志物的表達水平。上述結果表明MAGI2-AS3可能通過介導EMT相關標志物的表達發揮對喉鱗狀細胞癌侵襲轉移的調控，但具體調控機制還需要進一步明確。

TCGA公共數據庫中頭頸部鱗癌中有隨訪生存信息的患者516例，利用GEPIA軟件中的生存模塊分析發現，MAGI2-AS3高表達患者的中位生存時間略長于低表達患者，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

綜上所述，本研究結果初步證實喉鱗狀細胞癌組織和細胞中lncRNA MAGI2-AS3相對表達量降低，且T3+T4期、有淋巴轉移患者的MAGI2-AS3相對表達量均低于T1+T2期、無淋巴結轉移患者。在未來的研究中進一步明確MAGI2-AS3在喉鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲、轉移中的調控機制，對喉鱗狀細胞癌發生發展機制的理解及未來的分子靶向治療具有重要的意義。