低氧誘導胰腺癌細胞通過外泌體途徑分泌高遷移率族蛋白1

王鳴，宋廉，張禮榮，龔愛華，朱海濤，王冬青

（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江212013；2.江蘇大學附屬醫院影像科，江蘇 鎮江212001）

研究表明，低氧微環境及其誘導產生的各種炎癥因子在胰腺癌惡性生物學行為中起重要作用［1-2］。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是高度保守的核內非組蛋白，可從活化的免疫細胞中主動釋放，或者從受損、應激及壞死的細胞釋放［3-4］。研究表明，低氧可促進HMGB1被動釋放［5］。然而低氧環境下HMGB1的釋放途徑仍不明確，故本實驗以人胰腺癌細胞系PaTu8988為研究對象，探討低氧條件下腫瘤細胞釋放HMBG1的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胰腺癌PaTu8988細胞株購自中科院上海細胞研究所；DMEM高糖培養基，PBS（美國Hyclone公司）；澳洲胎牛血清（美國Gibco公司）；兔抗人單抗隆抗體低氧誘導因子-1（HIF-1α，美國Cell Signaling Technology公司）；兔抗人單克隆抗體β-微管蛋白、HSP70，兔抗人多克隆抗體HMGB1（英國Abcam公司）；鼠抗人單克隆抗體CD9、CD63、CD81，羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）；Cy3標記山羊抗兔IgG，FITC標記山羊抗小鼠IgG（碧云天生物科技公司）；超濾離心管100 kD，ECL發光液（美國Millipore公司）；外泌體提取試劑盒（美國Systembio公司）；DAPI溶液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細胞培養

常氧培養：將人胰腺癌PaTu8988細胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

低氧培養：將細胞置于密封的低氧培養盒中，向低氧培養盒里充入低氧混合氣［（1% O2，5% CO2，94% N2），購自南大恒通氣體廠］，持續充入10 min，然后將低氧培養盒轉移到37℃培養箱中培養。

1.3 外泌體提取

取常氧和低氧培養后的細胞上清液于50 mL離心管，4℃行2 000×g離心20 min，去除細胞碎片；取上清液，于高速離心管中，10 000×g離心30 min；取上清液至Millipore超濾管中，1 000×g離心30 min；取上清液，0.22μm濾器過濾至15 mL離心管中；按照外泌體提取試劑盒1∶5比例加入到濃縮液中，4℃靜置過夜；1 500×g離心30 min，棄上清液；1 500×g離心5 min；棄上清液后用100～500μL PBS重懸。

1.4 蛋白質印跡法檢測細胞相關蛋白的表達

收集PaTu8988細胞和上清液，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，100℃煮沸5 min；12 000×g離心5 min，所得上清液即為蛋白樣品。以每個泳道20μL蛋白樣品上樣，行10% SDS-PAGE；將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗，4℃孵育過夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；二抗37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發光試劑顯影，在凝膠成像系統上拍照并分析。一抗分別為兔抗人單克隆抗體HIF-1α（1∶1 000），兔抗人多克隆抗體HMGB1（1∶1 000），兔抗人單克隆抗體HSP70（1∶1 000），鼠抗人單克隆抗體CD9（1∶200），鼠抗人單克隆抗體CD63（1∶200），鼠抗人單克隆抗體CD81（1∶200）；內參為兔抗人單克隆抗體β-微管蛋白；二抗分別為羊抗兔二抗（均1∶10 000），羊抗鼠二抗（1∶10 000）。

1.5 免疫熒光法檢測PaTu8988細胞中HMGB1和CD63的表達

將蓋玻片自75%乙醇中取出，輕輕放入24孔培養板；將經過計數的細胞懸浮液接種于培養板中，將蓋玻片完全浸沒，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育過夜；設常氧組和低氧組，分別按照常氧和低氧處理；用PBS清洗細胞玻片1次；以4%低聚甲醛室溫固定20 min；PBST浸洗玻片3次；滴加3%BSA血清，室溫封閉30 min～1 h；棄封閉液，每張玻片滴加兔抗人多克隆抗體HMGB1（1∶1 000）和鼠抗人單克隆抗體CD63（1∶50）一抗混合液（1%BSA配制），放入濕盒，4℃孵育過夜；PBST浸洗3次，吸干多余液體；滴加Cy3標記山羊抗兔IgG和FITC標記山羊抗小鼠IgG二抗混合液（均為1∶200），濕盒中20～37℃孵育1 h；PBST浸洗3次；滴加DAPI，避光孵育10～15 min；PBST洗4次；吸干多余液體，封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 生物信息學分析

下載美國癌癥基因組圖譜計劃（The cancer genome atlas，TCGA）和高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）GSE16515中胰腺癌患者的臨床相關數據，分析健康者和患者胰腺組織中HMGB1 mRNA表達水平。將患者按HMGB1 mRNA表達水平分組，低于均值為HMGB1低表達組，高于均值為HMGB1高表達組，分析并比較兩組患者的生存期。

1.7 統計學分析

應用GraphPad Prism 6.0統計軟件對數據進行分析。實驗數據用均數±標準差（±s）表示，每組實驗獨立重復3次。兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，胰腺癌患者生存率分析采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGB1在胰腺癌標本中的表達

經分析，GSE16515數據庫中共有52例樣本，其中健康胰腺組織樣本16例，胰腺癌組織樣本36例。與健康組織相比，胰腺癌組織中HMGB1 mRNA呈高表達（t＝4.532，P＜0.01）。TCGA數據庫分析結果顯示，在胰腺癌患者中，HMGB1高表達者生存率明顯低于HMGB1低表達者（n＝182，χ2＝5.493，P＜0.05）。見圖1。

圖1 GEO和TCGA數據庫分析HMGB1的表達

2.2 低氧不同時間胰腺癌細胞培養上清液中HMGB1的含量

蛋白質免疫印跡結果表明，PaTu8988細胞在低氧培養6 h時，HIF-1α表達最高（P＜0.01）；在低氧培養48 h后，上清液中HMGB1的表達顯著增多（P＜0.05），細胞內HMGB1表達量明顯少于低氧培養6，12，24 h（P＜0.05），見圖2。由此表明，低氧誘導下，胞內HMGB1釋放到細胞外。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測細胞及培養上清液中相關蛋白的表達

2.3 低氧促進胰腺癌細胞釋放外泌體且外泌體中含有HMGB1

由圖3可見，與常氧組比較，低氧組外泌體的相關標記蛋白如CD9，CD63，CD81，HSP70和HMGB1均顯著高表達（t分別為6.752，9.528，7.421，11.07，7.538，P均＜0.01）。TEM透射電鏡結果顯示（圖4），外泌體提取試劑盒所提取的微囊泡具有膜結構，且直徑在100 nm左右。

2.4 低氧條件下HMGB1與外泌體共定位

免疫熒光結果表明，與常氧相比，低氧狀態下HMGB1（紅色熒光）與外泌體的標記物CD63（綠色熒光）的共定位增多。見圖5。

3 討論

腫瘤微環境與腫瘤的發生發展密切相關［6］。低氧是包括胰腺癌在內的多種實體腫瘤的共同特征。越來越多的研究表明，低氧及其誘導釋放的各種炎癥因子與腫瘤的治療后復發、轉移及腫瘤干細胞維持等密切相關［7-8］。HMGB1主要位于真核細胞胞核中，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而得名［9］。HMGB1在腫瘤組織中表達上調，且與腫瘤組織的惡性程度相關［10］。本研究的數據庫分析結果與上述報道結果一致，由此表明，HMGB1在腫瘤的發生發展中起重要作用。

圖3 外泌體相關蛋白和HMGB1的蛋白質印跡檢測結果

圖4 常氧和低氧上清液中外泌體的形態結構（TEM，×46 000）

圖5 常氧和低氧條件下HMGB1和外泌體的共定位

當細胞處于穩態時，HMGB1主要位于胞核內；當外界有適當的信號刺激細胞時，HMGB1的賴氨酸殘基被乙?；瘡亩尫诺桨?。目前HMGB1主要有兩種釋放方式，一種是主動釋放，如免疫細胞主動釋放HMGB1應對外源性微生物的入侵；另一種為被動釋放，即當細胞發生死亡，如壞死、凋亡、自噬性細胞死亡等，或者在多種應激情況下，如化療、放療、低氧等，都可使得HMGB1被動釋放至細胞外。本研究結果也證實低氧可促進HMGB1釋放。目前已知參與HMGB1被動釋放的通路有PARP1通路，RIP3通路，組織蛋白酶通路，抗氧化酶通路等。這些主動或被動釋放到胞外的HMGB1參與細胞的多種過程，如促進細胞分化［11-13］、炎癥反應、細胞遷移、組織再生［14］、血管生成［15-16］、細胞增殖［17］以及死亡［18］等。HMGB1在結腸癌、乳腺癌和肺癌等多種腫瘤的發生發展中起重要作用［19］，不但能增強腫瘤對治療的敏感性，還可在某些抗腫瘤的治療中致腫瘤產生抗性。

外泌體可由各種正常細胞分泌，如網織細胞、肥大細胞、樹突狀細胞等，也可由腫瘤細胞分泌。在某些應激條件下，外泌體釋放增多，如缺氧、氧化應激、pH改變、放療等［20］。研究表明，低氧能夠促進乳腺癌細胞釋放外泌體［21］。本研究結果表明，低氧能夠促進胰腺癌細胞釋放外泌體。外泌體的顯著特征就是會攜帶大量的核酸和蛋白。本研究結果顯示，低氧條件下人胰腺癌PaTu8988細胞釋放的外泌體可以攜帶HMGB1。且有研究表明，在氧化應激條件下，羊膜上皮細胞來源的外泌體會釋放HMGB1［22］。但HMGB1是如何轉運入外泌體及其生物學功能目前還不清楚，有待后續進一步研究。

綜上所述，低氧會促進人胰腺癌細胞釋放HMGB1，且可以通過外泌體途徑釋放。