尼莫地平對腦缺血大鼠自噬的影響

李魯博，陳波，錢堯，李巧玉

（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江212013；2.江蘇大學附屬人民醫院神經外科，江蘇 鎮江212002）

腦缺血會導致顱內缺氧，隨著缺血缺氧進展會導致氧糖剝奪／復氧損傷（oxygen-glucose deprivation／reoxygenation，OGD／R）的發生，并導致神經元及血管損傷，同時缺氧也會誘發自噬［1-3］。研究表明，適度的自噬可在外界環境刺激下維持細胞穩態，過度自噬則可能導致細胞死亡［4］。腦卒中發生后，顱內會出現缺血缺氧，從而導致自噬的發生［1］。尼莫地平是一種1，4-二氫吡啶類L-型鈣通道拮抗劑。該藥物具有神經保護作用，可改善動脈瘤性蛛網膜下腔出血預后、預防遲發型缺血性神經功能障礙及預防聽神經鞘瘤術后面神經和聽神經損傷［5-6］。研究表明，尼莫地平可以通過影響凋亡的發生影響腦卒中的預后［7］，但是未明確說明該藥物有無影響自噬發生的作用。在腦卒中的發生過程中，由于自噬的作用，神經及血管會受到損傷［3］。關于尼莫地平對腦卒中疾病有無神經血管保護作用尚不清楚。因此，本研究制備2種自噬模型：大鼠大腦中動脈局灶性線栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型即腦缺血模型，以及星形膠質細胞氧糖剝奪（OGD）模型；并將尼莫地平應用到2種模型中，通過蛋白免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、m-TOR／p-mTOR的表達變化，觀察該藥物在腦卒中疾病中的作用，以及其對自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級SD大鼠，雌雄各半，共90只，體質量220～250 g；新生SD大鼠（10只，出生3 d內），均由江蘇大學動物實驗中心提供［許可證號：SYXK（蘇）2013—0036］。尼莫地平注射液（拜爾醫藥保健有限公司）；兔抗LC3-Ⅱ抗體、兔抗Beclin-1抗體、兔抗m-TOR抗體、兔抗p-mTOR（S2448）抗體、鼠抗GFAP抗體、抗-GFAP／FITC熒光標記抗體均為美國CST公司產品；氯代三苯基四氮唑（TTC）購自上海玉博科技有限公司；CCK8細胞計數試劑盒（美國Sigma公司）；多聚賴氨酸（美國Gibco公司）。

1.2 大鼠分組及MCAO大鼠模型制備

將90只SD大鼠均分為3組，分別為尼莫地平組、缺血模型組、假手術組，每組30只。MCAO模型按照相關文獻方法［8］，以10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉大鼠，在顯微外科手術顯微鏡下，用眼科剪于大鼠頸部右側近正中央處切開皮膚，逐層剝離頸部肌肉群及舌下腺，充分顯露頸總動脈及其分支頸內、頸外動脈。夾閉頸內動脈并結扎頸總動脈、頸外動脈遠心段，于頸總動脈近頸內動脈處開一小口并插入線栓。手術完成后，在自然狀態下，等其蘇醒。在缺血2 h后，取出線栓，行再灌注處理。尼莫地平組及缺血模型組常規制備MCAO模型，尼莫地平組行1 mg／kg尼莫地平注射液腹腔注射，缺血模型組以等體積的0.9%生理鹽水腹腔注射。假手術組僅將絲線插入1 cm，以避免阻斷大腦中動脈血流，并同樣給予等體積0.9%生理鹽水腹腔注射。各組分別于造模前1 h、灌注后2 h、4 h行腹腔給藥。

1.3 Zea-Longa評分標準

Zea-Longa評分為常用MCAO大鼠模型判斷方法［9］。評分標準：0分，未見明顯異常，未見神經損傷癥狀；1分，將大鼠尾巴提起時，對側前爪不能完全伸展；2分，大鼠存在向缺血側旋轉的行為；3分，大鼠損傷側傾向癱瘓或傾倒，重度神經功能缺損；4分，無自發行走，意識喪失。當模型大鼠存在對側肢體癱瘓、行動異常、部分存在側向移動的現象時，即為模型制備成功。術后24 h進行評分，并選取符合2～3分標準的大鼠入組。

1.4 TTC染色檢測各組腦組織梗死體積

按Zea-Longa評分分組后，每組隨機選取3只大鼠；各組大鼠麻醉后，心臟放血并行生理鹽水灌注，隨后迅速取出大鼠腦組織并保持大腦完整，而后于-20℃冰箱中速凍20 min。去除腦膜等多余腦組織，并將冰凍大腦均勻切片。將腦切片置入2%TTC中均勻染色30 min。應用Image J軟件標定出正常組織（紅色）及梗死組織（白色）像素值，與標準比例尺像素值做比較，通過軟件自動計算出相關組織面積。將各腦切片梗死面積（非缺血側半球面積-缺血側半球未梗死區面積）相加后，乘以厚度（2 mm）為總的梗死體積。梗死體積／全腦體積×100%即為腦梗死體積百分比。

1.5 蛋白質印跡法檢測腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1和m-TOR／p-mTOR的表達

各組在評分分組后，取出新鮮大腦組織，配置蛋白裂解液，選取大腦基底節區缺血半暗帶組織，以超聲細胞破碎儀低溫勻漿，低溫冰柜保存備用。取制備好的腦組織勻漿，測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量10μL，行SDS-PAGE；將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜；轉膜后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h；分別滴入兔抗LC3-Ⅱ抗體（1∶400）、兔抗Beclin-1抗體（1∶500）、兔抗p-mTOR抗體（1∶1 000），并以β-肌動蛋白作為內參，4℃孵育過夜；予TBST洗膜5次，每次10 min；以2 mL的羊抗兔IgG二抗（FITC標記，1∶5 000）孵育，室溫緩慢搖動2 h；加ECL顯色劑曝光膠片處理，并用蛋白測定分析軟件計算條帶的光密度值。

1.6 HE染色檢測大鼠腦組織中細胞死亡情況

選取標記好的大鼠，予以水合氯醛麻醉，充分顯露心臟，分別以300 mL生理鹽水及4%低聚甲醛400 mL經心尖注入，并由右心耳放血。離斷大鼠頸部，取出大腦組織并固定于4%低聚甲醛中，標記并備用。將組織放入包埋盒中，升梯度濃度乙醇脫水處理，二甲苯透明；放入熔蠟箱中保溫浸泡；待石蠟完全浸入組織后即可冷卻凝固成型。于視交叉后5 mm處開始向后切片至基底節區，以3μm厚度開始取材。染色前需脫蠟，二甲苯浸泡，降梯度濃度乙醇浸泡。行蘇木精-伊紅染色，具體過程為蘇木精染液染色10 min；水洗多余染液，1%鹽酸乙醇分色片刻；鏡檢控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止，約10 s；流水沖洗15～30 min，蒸餾水洗；0.5%伊紅染液染色5 min；依次經70%、85%、95%、100%乙醇脫水，各級為2～3 min；二甲苯透明2次，每次1 min；擦去切片周圍多余二甲苯，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固。

1.7 星形膠質細胞培養及純化

取新生SD大鼠，心臟放血后，取大腦組織，仔細剔除腦膜、血管、小腦等，取大腦皮層并剪成組織塊，胰酶消化，吹打成細胞懸液，室溫1 000 r／min離心5 min；重懸后并篩網過濾。將細胞接種于多聚賴氨酸包被的培養瓶中，每3 d換液1次，培養7～10 d，根據膠質細胞間黏附性不同行星形膠質細胞純化。具體方法：將培養瓶置于恒溫振蕩器中，37℃180 r／min振蕩5 h，去除上層細胞；將下層細胞消化、重懸，繼續置于多聚賴氨酸包被的培養瓶中培養。重復上述方法至第4代細胞，方可用于細胞實驗。將純化后的星形膠質細胞消化、離心、重懸，5%牛血清白蛋白封閉10 min。PBS洗滌，離心重懸，重復3次。加入1%牛血清白蛋白稀釋的一抗GFAP于4℃孵育過夜。PBS再次洗滌，加入抗GFAP／FITC熒光標記抗體，4℃避光孵育1 h。PBS清洗3次，上流式細胞儀檢測其純度。

1.8 糖氧剝奪實驗模型建立

取純化后的星形膠質細胞，待細胞在培養瓶中生長到一定密度后，棄培養液，并加入PBS，將培養瓶置于OGD實驗裝置中，加入N2∶CO2＝0.95∶0.05（v／v）的混合氣體，置于培養箱中培養。

1.9 CCK8法檢測星形膠質細胞活性

選取純化后的星形膠質細胞，接種于96孔板，分別設置空白對照組、OGD模型組、尼莫地平組，細胞按常規培養。待細胞鋪滿孔底90%后，空白對照組無特殊處理，OGD模型組僅制備OGD模型，尼莫地平組于氧糖剝奪模型制備前1 h予5μg／mL尼莫地平預處理。設置5個復孔，分別給予OGD處理0，1、2、4、8 h，每孔加入10μL CCK8試劑，繼續孵育3 h，采用酶標儀測定各孔光密度（D）。按以下公式計算細胞活性，細胞活性（%）＝［D（加藥）-D（空白）］／［D（0加藥）-D（空白）］×100。D（加藥）：具有細胞、CCK8溶液和尼莫地平預處理／OGD模型孔D值；D（空白）：具有培養基和CCK8溶液而沒有細胞的孔D值；D（0加藥）：具有細胞、CCK8溶液而沒有尼莫地平預處理／OGD模型孔D值。

1.10 統計學處理

應用SPSS 17.0進行統計學分析，所有數據行方差齊性檢驗及正態檢驗后，對各組數據行單因素方差分析，多組數據間應用LSD-t檢驗進一步分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Zea-Longa評分比較

由圖1可見，缺血模型組和尼莫地平組Zea-Longa評分均明顯高于假手術組（P＜0.05）；其中，缺血模型組評分明顯高于尼莫地平組（t＝2.585，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織Beclin-1、LC3-Ⅱ、m-TOR／pmTOR蛋白表達

與假手術組相比，尼莫地平組與缺血模型組LC3-Ⅱ及Beclin-1表達，m-TOR蛋白與p-mTOR表達均明顯增高（P均＜0.05）。與缺血模型組相比，尼莫地平組LC3-Ⅱ及Beclin-1表達明顯下降，m-TOR蛋白及p-mTOR表達明顯增加（P＜0.05）。見圖2。

2.3 腦組織HE染色結果

由圖3可見，假手術組腦組織基本形態結構相對完整；缺血模型組腦組織有散在的空腔結構，間質呈水腫態，存在大量神經元變性、壞死；尼莫地平組與缺血模型組比較，缺血灶周圍區域中壞死灶明顯減少，細胞死亡數量降低。見圖3。

圖1 各組大鼠Zea-Longa評分比較

圖2 免疫印跡法檢測各組大鼠腦組織中相關蛋白的表達

圖3 3組腦組織病理形態（HE染色×200）

2.4 腦組織TTC染色結果

由圖4TTC染色結果可見，假手術組未發生梗死；尼莫地平組及缺血模型組梗死體積均大于假手術組（P＜0.05）；且缺血模型組梗死體積明顯大于尼莫地平組（t＝3.859，P＜0.05）。

圖4 TTC染色結果及腦梗死體積百分比

2.5 星形膠質細胞細胞活性比較

應用GFAP標記星形膠質細胞后行流式細胞術檢測，星形膠質細胞純度為98.36%（圖5）。CCK8實驗表明，隨著時間的推移，OGD模型組中星形膠質細胞存活下降，細胞損傷加重；尼莫地平組細胞仍有損傷，但損傷程度低于OGD模型組（圖6）。

圖5 流式細胞儀檢測星形膠質細胞純度結果

圖6 CCK8檢測星形膠質細胞活性

2.6 各組星形膠質細胞Beclin-1、LC3-Ⅱ、m-TOR蛋白表達

與OGD模型組相比，尼莫地平組LC3-Ⅱ及Beclin-1表達明顯降低，m-TOR蛋白及p-mTOR蛋白表達明顯增加（P均＜0.05）。尼莫地平組及OGD模型組各種蛋白表達程度均明顯高于空白對照組（P均＜0.05）。見圖7。

圖7 各組星形膠質細胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ和m-TOR蛋白表達

3 討論

腦卒中發病部位特殊，對其研究通常依賴于建立相關模型，常用的模型有雙動脈法、四血管法、MCAO法等腦缺血模型。其中前兩種方法操作相對簡單，但疾病模型構筑的病理環境與機體腦卒中存在差異［10］。大腦中動脈是頸內動脈最大的分支，也是頸內動脈的直接延伸，是人類腦卒中發病的常見部位［1］。通過頸內動脈可以將線栓直接通入大腦中動脈并制造局灶性腦缺血，因此，MCAO模型被廣泛應用［11］。其優點有操作創傷小，簡便易行，易于篩選成功模型等；此外，選用MCAO模型更有利于重復實驗，并最大可能地復原人腦缺血疾病相關病理環境。OGD實驗是在氧糖剝奪后利用其損傷誘發自噬發生的一種模型，而星形膠質細胞則是顱內重要的細胞，利用OGD實驗研究細胞層面自噬的發生，對研究自噬機制及相關通路有著重要意義［12］。

尼莫地平可特異擴張腦血管、增加冠脈血流量，對外周血管影響較小，在降低血壓同時，保證顱內供血，對缺血性腦損傷有保護作用［13］。本研究通過制備MCAO模型并行大腦組織HE染色發現，假手術組腦組織基本形態結構相對完整，無明顯梗死缺血；缺血模型組腦組織有散在的空腔結構，間質呈水腫態，存在大量神經元變性、壞死。與缺血模型組比較，尼莫地平組缺血灶周圍區域中壞死灶明顯減少，細胞死亡數量降低。同時TTC染色結果也表明，應用尼莫地平處理后，大鼠腦組織梗死體積較單純缺血再灌注損傷時要小。由此說明，應用尼莫地平可以降低局部腦缺血所致的神經損傷。

自噬是一種細胞自我消亡的過程，主要有兩種自噬分子調控機制，一種是m-TOR相關的通路，另一種是m-TOR非依賴性通路［14］。Beclin-1是一種自噬相關蛋白，與酵母Atg6分子相類似，在處于惡劣細胞內環境時，Beclin-1的降解物可與Ⅲ型PI3K復合物結合，影響m-TOR相關通路，促進自噬發生［15］。LC3-Ⅱ蛋白是自噬指示蛋白，直接反應自噬發生的程度［16］。本研究結果顯示，與假手術組相比，尼莫地平組及缺血模型組Belcin-1及LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯升高；與缺血模型組相比，尼莫地平組Belcin-1及LC3-Ⅱ的表達明顯降低。同時OGD模型作為細胞層面的自噬模型同樣證明了星形膠質細胞中可以發生自噬；與OGD模型組相比，尼莫地平組Belcin-1和LC3-Ⅱ表達同樣降低。此外，應用尼莫地平處理后，細胞損傷率有所降低。由此說明，隨著腦卒中的發生，自噬亦會在腦組織中發生，應用尼莫地平可抑制自噬發生。同時，細胞層面的OGD實驗及CCK8實驗也證明，尼莫地平可以提高自噬發生后星形膠質細胞的活性，從而降低自噬對星形膠質細胞的損傷。綜上所述，本研究表明，尼莫地平對腦卒中有一定的神經保護作用，并存在一定的治療作用，但具體作用機制及是否可以應用于臨床治療仍有待進一步研究。