鮑曼不動桿菌莢膜厚度對鼠巨噬細胞炎癥復合體活化的影響

吳亮，陸娟，2，王廷廷，萬晟霞，鄒治情，戴曉玥，夏雯，陰晴，陳盛霞，許化溪

（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江212013；2.江南大學附屬醫院檢驗科，江蘇 無錫214062；3.江蘇大學第四附屬醫院神經內科，江蘇 鎮江212001；4.江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇 鎮江212001）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）是重要的機會致病菌，廣泛定植于人類皮膚、胃腸道、上呼吸道中，可引起各種醫院內獲得性感染，如肺炎、尿路感染、菌血癥和腦膜炎等。近年來鮑曼不動桿菌臨床分離率逐年升高，已成為主要的醫院內感染病原體［1］。鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類、喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素的大范圍耐藥，特別是對碳青霉烯類抗生素耐藥，給臨床治療提出了嚴峻挑戰［2］。

鮑曼不動桿菌侵襲宿主細胞過程中可以導致細胞嚴重損傷，但其確切機制仍不清楚。目前的研究多集中于其較強耐藥性和頑強生存能力，卻較少涉及致病機制及毒力因子［3］。鮑曼不動桿菌有多種毒力因子，包括外膜蛋白、內毒素、磷脂酶和莢膜等。莢膜是細菌經典毒力因子，在細菌致病過程中發揮重要作用［4］。研究表明，細菌莢膜成分可以激活人體固有免疫細胞內重要的多蛋白復合物——炎癥復合體，使細胞感知病原微生物的侵入并啟動免疫防御功能，殺傷、清除病原微生物或產生免疫損傷反應。但目前尚缺乏鮑曼不動桿菌激活炎癥復合體的研究［5］。本研究通過比較兩株莢膜厚度顯著不同的鮑曼不動桿菌對鼠巨噬細胞炎癥復合體激活能力的差異，探討鮑曼不動桿菌莢膜在細菌激活固有免疫細胞及其致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

鮑曼不動桿菌分離于江蘇大學附屬醫院的患者痰液中，純化后凍存于15%脫脂牛奶中備用；鼠巨噬細胞（Raw 264.7）購自上海中科院細胞庫；哥倫比亞瓊脂培養基購自青島海博生物技術有限公司；羊血購自貝瑞特生物公司；剛果紅染料購自上海生工生物有限公司；結晶紫染液購自北京索萊寶生物公司；RPMI 1640培養基為HyClone（北京）有限公司產品；胎牛血清和胰蛋白酶（1∶250）為美國Gibco公司產品；細胞總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒（SYBR Green染料法）均購自南京Vazyme公司；活性氧檢測試劑盒（DCFHDA熒光探針法）購自碧云天公司。

PCR引物由蘇州泓迅生物公司合成，各引物序列如下，NLRP3上游：5′-AACAGCCACCTCACTTCCAG-3′，下游：5′-CCAACCACAATCTCCGAATG-3′；Caspase-1上游：5′-GCACAAGACCTCTGACAGCA-3′，下游：5′-TTGGGCAGTTCTTGGTATTC-3′；IL-1β 上游：5′-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3′，下游：5′-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3′；GAPDH 上游：5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游：5′-ACTCCACGACATACTCAGC-3′。

1.2 細菌莢膜的剛果紅法染色

細菌莢膜的染色根據王懷兵等［6］報道的剛果紅染色方法并加以改進。將4%的剛果紅染液與胎牛血清按4∶1混勻，取1滴滴加于玻片上，挑取適量對數生長期的鮑曼不動桿菌落與此充分混合，按推制血片的方法制成推片，自然干燥后用5% HCl室溫下脫色1 min，細流水沖洗，再加結晶紫染液染色1 min，細流水沖洗，自然干燥后鏡檢。挑取兩株莢膜厚度差異顯著的細菌用于后續研究。

1.3 Raw 264.7細胞培養和細菌感染

按常規方法培養Raw 264.7細胞，待細胞生長至70%～80%時，用0.25%胰酶溶液消化細胞，洗滌后計數，計數5×105個細胞接種于6孔細胞培養板中，置于37℃、5%CO2環境中繼續培養48 h。取鮑曼不動桿菌的新鮮振搖培養物，以無菌PBS緩沖液洗滌并調整細菌密度為1×109／mL［D（600 nm）＝1］。在生長融合至70%的Raw 264.7細胞（此時各孔細胞數量為1×106個）中分別加入兩株不同莢膜厚度的鮑曼不動桿菌（細菌數量∶細胞數量＝10∶1），置于37℃、5%CO2環境中培養，于感染后1 h、3 h和6 h收集細胞樣本。

1.4 實時定量PCR檢測細胞NOD樣受體家族3（NLRP3）、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達

嚴格按照Vazyme公司總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA。實時定量PCR反應條件是95℃預變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸45 s，共35個循環。以GAPDH為內參，NLRP3、Caspase-1和IL-1β的基因表達量結果用2-△△Ct法表示，實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞活性氧

以無血清RPMI 1640培養液稀釋DCFH-DA熒光探針至終濃度為10μmol／L的工作液，并將上述收集的細胞重懸于DCFH-DA工作液中，于37℃細胞培養箱內孵育20 min，間隔5 min顛倒混勻使探針和細胞充分接觸。孵育結束后使用無血清RPMI 1640培養液反復洗滌細胞3次以完全除去未進入細胞內的DCFH-DA熒光探針，采用流式細胞儀檢測細胞熒光強度。

1.6 統計學分析

應用SPSS16.0統計學軟件，采用t檢驗分析感染組和對照組細胞基因和活性氧表達差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌莢膜染色結果

經剛果紅染色后，鮑曼不動桿菌莢膜不著色，菌體被染成紫黑色，背景染成橘紅色。經多次染色鑒定，我們選擇出兩株莢膜厚度不同的鮑曼不動桿菌用于后續研究，分別命名為Ab-B（薄莢膜菌株）和Ab-H（厚莢膜菌株）。從圖1可見，Ab-H菌株周圍有一個明顯白圈，不被染料著色；而Ab-B菌株周圍無明顯白圈。

圖1 鮑曼不動桿菌剛果紅染色結果

2.2 鮑曼不動桿菌感染后Raw 264.7細胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達

實時定量PCR檢測結果顯示，Ab-B菌感染后，Raw 264.7細胞NLRP3 mRNA表達量較對照組差異無統計學意義（P＞0.05），Caspase-1和IL-1β表達量較對照組顯著升高（P＜0.05）；Ab-H菌感染后Raw 264.7細胞NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表達量較對照組均明顯上調（P＜0.05），且NLRP3和IL-1β表達量顯著高于Ab-B菌感染組（P＜0.05），但兩組Caspase-1表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 鮑曼不動桿菌感染后Raw 264.7細胞NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表達量

2.3 鮑曼不動桿菌感染后Raw 264.7細胞活性氧表達

兩株鮑曼不動桿菌感染Raw 264.7細胞后，1 h時感染組細胞活性氧表達量與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；3 h時感染組細胞活性氧表達量較對照組顯著上升（P＜0.05），Ab-H株感染細胞活性氧表達量顯著高于Ab-B株感染細胞（P＜0.05）；6 h時感染組細胞活性氧表達量進一步上升，Ab-H株感染細胞活性氧表達量顯著高于Ab-B株感染細胞（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

鮑曼不動桿菌是引起醫院內感染的重要條件致病菌，隨著近年來鮑曼不動桿菌耐藥性愈加嚴重，可供臨床醫生選擇的抗生素種類有限。但臨床中并非所有的多重耐藥鮑曼不動桿菌都會引起患者感染癥狀［7］。鮑曼不動桿菌易于在人體上呼吸道、泌尿生殖道和消化道等部位黏膜表面定植存在，其耐藥性強，但不會激活免疫反應引起患者感染癥狀。因此患者呼吸道等部位檢出鮑曼不動桿菌時，還需要鑒別其定植性或致病性，以便于臨床醫生選擇合適治療方案，避免抗生素的過度治療。但目前對于鮑曼不動桿菌定植和致病的確切機制尚不完全清楚，嚴重阻礙了鮑曼不動桿菌的防治［8］。開展鮑曼不動桿菌激活宿主免疫系統機制的研究，可為鮑曼不動桿菌的治療提供一條新思路［9］。

圖3 各組細胞活性氧表達量

目前鮑曼不動桿菌毒力因子研究較少，現已明確的毒力因子有莢膜、外膜蛋白、脂多糖和外膜囊泡等［10］。莢膜是細菌經典的毒力因子，在細菌致病過程中發揮重要作用。莢膜可以保護細菌，使細菌能夠在宿主吞噬細胞或腹腔積液中長時間存活，避免被宿主免疫細胞吞噬清除，并對宿主造成嚴重損害［11］。臨床檢驗人員通常會將痰液涂片中存在于白細胞或膿細胞內的細菌判為致病菌，此類細菌通常具有較厚的莢膜，以利于細菌在白細胞中長時間存活［12］。

進一步研究發現，莢膜是細菌重要的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），可以被宿主天然免疫系統識別并激活免疫反應［13］。人體依靠一整套復雜的天然免疫機制和獲得性免疫機制識別和清除侵入的病原菌，保護機體免受病原菌的侵害。宿主細胞通過模式識別受體（patten recognition receptors，PRRs）來識別鮑曼不動桿菌莢膜（即PAMPs）［14］。人類有多種不同功能的PRRs，其中存在于細胞質中的NOD樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）是目前研究的熱點［15］。NLRs的N-端是在蛋白之間有相互作用的效應結構域，C-端是識別PAMPs的亮氨酸富集結構域，中間部分為NOD結構域。在人體中，由NLRs、凋亡相關點樣蛋白（ASC）和Caspase-1相互作用形成“炎癥復合體”，用于識別胞內病原微生物及其代謝產物，通過激活Caspase-1，使IL-1β、IL-18和IL-33等促炎細胞因子成熟并釋放到胞外，從而調節免疫應答并引起炎癥反應［16］。現已報道的炎癥復合體包括NLRP1、NLRP3、IPAF（the IL-1β-converting enzyme-protease activating factor）和AIM-2（absent in melanoma 2）4種，NLRP3是目前研究最多且最明確的一個，能夠被多種病原體所激活，包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和流感病毒等，但目前缺乏鮑曼不動桿菌對宿主NLRP3激活的研究［17］。

現已發現鮑曼不動桿菌誘發肺部感染的關鍵在于NLRP3炎癥復合體的活化，但其活化具體機制仍不完全清楚［18］。莢膜是鮑曼不動桿菌重要毒力因子，通常情況下鮑曼不動桿菌的莢膜不明顯，傳統墨汁負染法檢測效果較差。本研究中我們采用改良的剛果紅染色法檢測鮑曼不動桿菌莢膜，該方法操作簡單，可以清晰地觀察到鮑曼不動桿菌莢膜的厚薄程度，涂片可以長期保存，便于隨時復核。

我們的結果表明，鮑曼不動桿菌感染Raw 264.7細胞后，可以激活細胞活性氧表達，以及NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表達量，進而激活細胞炎癥復合體的形成。厚莢膜菌株激活Raw 264.7細胞活性氧表達能力顯著強于薄莢膜菌株，并且其活化Raw 264.7細胞NLRP3和IL-1β表達能力也明顯強于薄莢膜菌株。該結果與肺炎克雷伯菌莢膜活化炎癥小體能力相同［19］，表明鮑曼不動桿菌莢膜是潛在活化炎癥復合體的重要因子，可以通過上調細胞活性氧表達進而激活炎癥小體，導致患者免疫系統識別并清除鮑曼不動桿菌。活性氧是目前公認的炎癥復合體激活因子［20］，主要來源于細胞線粒體。大量細菌莢膜可以激活宿主免疫細胞的吞噬反應，進而引起細胞“呼吸爆發”，產生超量活性氧，使NLRP3活化，導致人體正常組織和器官的損傷［21］。由此推測，莢膜厚度是影響鮑曼不動桿菌活化巨噬細胞炎癥復合物能力的重要因素，具有厚莢膜的鮑曼不動桿菌可以誘導巨噬細胞產生過量活性氧，活化炎癥復合體，使宿主固有免疫系統識別并清除鮑曼不動桿菌或進一步引起正常組織和器官損傷。