外源GA3和PBZ對桃枝條生長及其GA相關基因表達的影響

譚 彬，王 婷，郝鵬博，鄭先波，程 鈞，王 偉，馮建燦

(1.河南農業大學 園藝學院，河南 鄭州 450002；2.河南省果樹瓜類生物學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

桃(PrunuspersicaL.)是深受人們喜愛的世界性大宗水果。2016年我國桃種植面積達836 500 hm2，總產量1 444萬t，分別占世界總量的51.0%和57.8%，產量和收獲面積均居世界首位[1]。隨著我國對桃果需求量的增加及果樹栽培技術的提高，簡約化栽培已成為果樹產業規范化管理和集約化經營發展的一個新趨勢。桃矮化品種具有節間短、早結果、早豐產、產出果實品質較高和修剪整形技術容易掌握等眾多優點。我國是桃的起源中心，桃的遺傳資源種類豐富，生產中通過傳統育種手段已經培育出一些矮化品種或類型[2-5]，但這些矮化品種主要以觀賞型為主，花果兼用或果用品種較少。目前生產上桃栽培品種由于營養生長旺盛，以至生產中依賴頻繁修剪和施用植物生長調節劑對樹體生長進行調控，這些措施費工費時，導致生產成本增加，且容易產生激素殘留等安全方面的問題。劉偉等[6]對我國桃主產區山東省進行了桃生產成本分析，結果表明，桃生產過程中勞動力成本占據生產總成本的53%，其中整形修剪及植物生長調節劑的施用占總用工量的至少25%。因此，開展控制桃節間長度的分子研究，嘗試利用基因工程手段培育適宜矮化密植的矮化桃品種對實現桃簡約化栽培具有重要意義。

在果樹生產中通過使用植物生長調節劑來調節果樹生長、控制樹勢、調控植物的多種生長發育過程，目前常用的植物生長調節劑有赤霉素(Gibberellin，GA)和多效唑(Paclobutrazol，PBZ)2種。GA最顯著的作用為促進植物莖端和節間伸長[7]，當其合成受到抑制或信號轉導途徑受到阻遏都會引起活性GA水平的改變并最終導致植物的矮化；PBZ主要通過抑制GA生物合成過程中由貝殼杉烯到貝殼杉烯酸氧化過程來抑制GA的生物合成[8]，在植物生長發育過程中通過抑制GA的合成抑制枝條生長，導致節間變短。

目前GA的合成代謝途徑和信號轉導途徑已研究的較為透徹，相關基因在植物生長發育過程中的功能相繼被報道。其中KO(Ent-kaurene oxidase，內根貝殼杉烯氧化酶)、GA20-ox(Gibberellin 20-oxidase)和GA3-ox(Gibberellin 3-oxidase)是GA合成途徑中關鍵的合成酶，現有研究證明，該類氧化酶基因發生突變功能喪失后均導致植株矮化[9-11]。Itoh等[9]對1個水稻半矮化突變體進行研究，發現其半矮化性狀是由KO基因的突變導致GA合成受抑制而產生；Xu等[12]發現擬南芥ga5突變體的半矮化是由于AtGA20-ox基因內1個點突變(G/A)導致基因功能改變影響活性GA的產生而形成；Carrera等[13]研究發現，外源GA3處理馬鈴薯葉片后GA20-ox基因的表達量明顯被抑制，證明該基因具有明顯的負反饋調節作用；Reinecke等[14]研究發現，過表達PsGA3-ox1基因的轉基因豌豆節間明顯伸長，且活性GA1水平升高。GA2-ox(Gibberellin 2-oxidase)為GA代謝途徑中重要的代謝酶，其參與植物體內活性GA的平衡調節過程，該基因過表達后會引起植株出現矮化表型[15]。

GA信號轉導途徑的基本元件主要由活性GA受體蛋白GID1(Gibberellin insensitive dwarf1)[16]、GA信號途徑阻遏蛋白DELLA[17]、泛素E3連接酶復合體(SCFSLY1/GID2)[18]和26S蛋白酶[19]等組成?，F有的研究已明確，植物體內的活性GA被受體蛋白GID1感知后與DELLA蛋白互作，形成GA-GID1-DELLA復合體促進DELLA蛋白的降解；DELLA蛋白功能為抑制植物GA效應來抑制植物生長，是GA信號途徑的負調控因子。Dill等[20]發現,擬南芥DELLA蛋白特征結構域的缺失直接導致了矮化表型的出現，并且在敲除該基因后GA信號轉導途徑完全被抑制；Li等[21]發現,1株油菜矮化突變體，由于其GID1基因啟動子序列發生突變造成植株對活性GA不敏感從而導致矮化性狀的產生。SLY1(SLEEY1)屬于F-box蛋白家族，其與DELLA蛋白互作并介導DELLA蛋白的降解，是GA信號轉導途徑中的正調控因子，該基因的突變會引起植株出現矮化表型[22]。隨著研究的不斷深入，發現植物乙烯信號轉導通路中的重要轉錄因子ERF類轉錄因子，其在GA合成和信號轉導途徑中也發揮重要作用。Zhou等[23]發現，AtERF11是GA合成和信號轉導途徑中的正調控因子，AtERF11基因的過表達導致活性GA含量升高，且植株表現出明顯的節間伸長。

GA合成代謝和信號轉導途徑相關基因在模式植物和大田作物上的研究為該途徑在木本果樹上的研究奠定了基礎。Boss等[24]研究發現，葡萄品種莫尼耶皮諾中1個單堿基的突變導致DELLA特征結構域發生改變而產生矮化表型；Zhu等[25]研究發現，在蘋果中過量表達擬南芥Atgai基因可導致蘋果節間長度降低、節數減少，表現矮化表型；Hollender等[26]發現1株桃的矮化突變體，其矮化表型是由PpeGID1c基因的無義突變導致。上述研究為利用GA途徑相關基因實現果樹矮化育種提供了新思路?；诖?，選取對外源GA3和PBZ敏感性適中的黃水蜜桃[27]為試驗材料，對其進行外源GA3和PBZ處理，研究其在不同處理后新梢生長變化規律以及嫩梢組織中GA合成代謝和信號轉導途徑相關基因表達量的變化，為通過基因工程手段獲得桃矮化新種質奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為黃水蜜桃1年生嫁接苗，于2016年春定植于河南農業大學毛莊科教園區，定植時接穗枝條上留3～4個芽后剪去上部枝條，萌發后留下長勢較一致芽，抹去其余嫩芽，并進行常規管理。

1.2 生長指標測量及取樣方法

1.2.1 外源GA3和PBZ處理試驗 于黃水蜜桃嫩梢長至10 cm長時(4月29日)，對其進行葉面噴施處理，處理1：100 mg/L GA3；處理2：1 500 mg/L PBZ，均以噴施清水作為對照。每處理隨機選取3株為一小區，重復3次，分別于噴施0，2，5，8，11，14，17 d對黃水蜜桃新梢長度及凈生長量進行調查；并于處理后0 d、2 h、8 h、2 d、5 d、8 d、11 d、14 d和17 d采集嫩梢，采后迅速放入液氮中，之后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續基因表達量的測定。

1.2.2 外源GA3逆轉處理試驗 通過分析上述PBZ處理后黃水蜜桃嫩梢生長指標測量結果，發現處理后17 d時嫩梢生長受到較強的抑制，故選取PBZ處理后17 d的黃水蜜桃為試材，噴施100 mg/L GA3進行逆轉處理，以噴施清水作為對照。隨機選取3株為1個小區，重復3次，分別于噴施0，3，6，9，12 d時對黃水蜜桃新梢長度及凈生長量進行調查；并于處理后0 d、2 h、8 h、3 d、6 d、9 d和12 d采集嫩梢，采后迅速放入液氮中，之后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續基因表達量測定。

1.3 GA代謝和信號轉導途徑相關基因表達水平的測定

黃水蜜桃嫩梢組織總RNA的提取參照柱式植物總RNA提取試劑盒(Spin Column Plant total RNA Purification Kit)方法進行，購于生工生物工程(上海)股份有限公司。RNA的濃度及質量分別使用分光光度計NanoDrop 2000(Thermo Scientific)和1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。cDNA的合成參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進行操作，反轉錄所得cDNA稀釋至200 ng/μL，用于后續試驗。熒光定量Mix(PrimeScript RT Master Mix)購于美國應用生物系統公司。與GA合成代謝和信號轉導途徑相關基因CDS序列從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbest/)數據庫下載，利用Primer 3.0在線工具(http://primer3.ut.ee/)設計實時熒光定量PCR引物，目的基因及內參基因定量引物信息見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成。在ABI Prism 7500 FAST Sequence Detection System(Applied Biosystems，Madrid，CA，USA)上進行qRT-PCR分析，以18SrRNA作為內參基因。反應體系和反應程序參照郝鵬博[28]的方法，每個反應設置3次重復。

表1 實時定量PCR引物Tab. 1 Primers of Real-time quantitative PCR

1.4 數據統計與分析

本試驗數據采用Excel 2016和SPSS 17.0進行數據處理及差異顯著性分析，差異顯著性分析檢驗方法為t-檢驗，P<0.05。利用2-ΔΔCt法分析處理qRT-PCR反應數據，使用SigmaPlot 12.5進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 外源GA3和PBZ處理對黃水蜜桃新梢生長及GA合成代謝和信號轉導途徑相關基因表達的影響

2.1.1 外源GA3和PBZ處理對黃水蜜桃新梢生長的影響 對黃水蜜桃1年生植株分別噴施GA3和PBZ后，定期對不同處理新梢生長量及凈生長量進行觀察測量，結果如圖1所示，外源GA3噴施后隨著時間的延長新梢生長量均高于對照處理，而PBZ處理后新梢生長量均低于對照處理，表明外源GA3對新梢生長具有促進作用，PBZ對新梢生長具有抑制作用。此外，對比不同處理的新梢凈生長量，發現GA3處理后新梢凈生長量高于對照，并在GA3處理后8 d時新梢凈生長量顯著高于對照；PBZ處理后新梢凈生長量低于對照，其新梢凈生長量的變化趨勢與GA3處理一致，但新梢生長量在PBZ處理后5，8，14 d時均顯著低于對照，且在PBZ處理后17 d時極顯著低于對照，表明PBZ處理對新梢生長具有明顯的抑制作用。

2.1.2 外源GA3和PBZ處理對GA合成代謝途徑相關基因表達的影響 在黃水蜜桃新梢生長過程中，對不同處理GA合成代謝途徑相關基因在嫩梢組織中的表達量進行測定。結果如圖2所示，在外源GA3處理后，與GA合成相關基因KO和GA3-ox的表達量呈現出相同的表達模式，即在處理初期的2 h內2個基因的表達量均略低于對照，此后2個基因表達量呈現先下降后升高趨勢，KO基因在處理后17 d時達到峰值；而GA20-ox基因的表達量在處理初期的5 d內與對照類似均處于近乎不表達狀態，此后其表達量逐漸上升，在處理后14 d時表達量高于對照，且在17 d時表達量達到峰值，與對照相比上調30倍。在外源PBZ處理后，與GA合成相關基因KO、GA3-ox和GA20-ox的表達趨勢各不相同，其中KO基因在處理初期8 h內的表達量低于對照，此后表達量持續高于對照，直到處理后8 d時表達量達到峰值，且高于對照，此后表達量下降并低于對照；GA3-ox基因的表達量在處理初期的8 d內均低于對照，在處理11 d時達到峰值，且高于對照，此后其表達量急劇下降；GA20-ox的表達量在處理初期5 d內與對照類似均處于近乎不表達狀態，此后表達量快速升高，在11 d時達到峰值，且低于對照，隨后其表達量隨著處理時間的延長下降并在處理后17 d時低于對照。

圖1 GA3和PBZ處理后黃水蜜桃新梢的生長變化Fig.1 Changes of shoot growth after GA3 and PBZ treatments on Huangshuimi

與GA代謝相關基因GA2-ox的表達量在不同處理中呈現出相似的表達趨勢，在處理前期的8 d內2種處理與對照的GA2-ox基因的表達量均處于近乎不表達狀態，在處理11 d時GA2-ox基因的表達量達到峰值且均高于對照，此后GA2-ox基因的表達量在2種處理和對照中都表現出先下降(14 d)后略微上升(17 d)的趨勢。

圖2 GA合成代謝途徑相關基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達量Fig.2 The expression of genes related to the gibberellin biosynthesis pathway in shoot of Huangshuimi

2.1.3 外源GA3和PBZ處理對黃水蜜桃GA信號轉導途徑相關基因表達的影響 在黃水蜜桃新梢生長過程中，對不同處理GA信號轉導途徑相關基因在嫩梢組織中的表達量進行檢測。結果如圖3所示，在外源GA3處理后，嫩梢中DELLA、GID1c和SLY1基因在處理后8 d內與對照類似，均處于近乎不表達狀態，隨后表達量逐漸升高，在14 d時達到峰值，且此時DELLA、GID1c和SLY1基因的表達量均高于對照，此后表達量隨處理時間的延長而降低，而對照處理中DELLA、GID1c和SLY1基因的表達量均在11 d時達到峰值，其后表達量隨著處理時間的延長而降低；ERF11基因在處理2h內表達量高于對照,隨后下降且趨于不表達，在處理后8 d時表達量逐漸升高并于14 d時達到峰值且高于對照。在外源PBZ處理后，DELLA、GID1c和SLY1基因與對照呈現出相似的表達模式，均在處理后8 d內處于近乎不表達狀態，在處理后11 d時達到峰值，且表達量持續低于對照；ERF11基因表達趨勢與對照類似，其表達量在處理后2,11 d時出現2個高峰，且與對照相比，ERF11基因表達量始終低于對照。

圖3 GA信號轉導途徑中相關基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達量Fig.3 The expression of genes related to the GA signaling transduction pathway in shoot of Huangshuimi

2.2 外源GA3處理對PBZ的逆轉過程中黃水蜜桃新梢生長及GA合成代謝和信號轉導途徑相關基因的表達

2.2.1 逆轉處理過程中黃水蜜桃新梢生長變化 對逆轉處理后黃水蜜桃新梢生長量的測量結果如圖4所示，經過PBZ處理后的黃水蜜桃新梢生長量在外源GA3處理后有所增加，且始終高于對照；GA3逆轉處理后新梢凈生長量隨著處理時間的延長始終高于對照，且在處理后3,6 d時均顯著高于對照。表明外源GA3處理可有效逆轉PBZ對新梢生長的抑制作用，促進新梢生長。

2.2.2 逆轉處理對黃水蜜桃GA合成代謝途徑相關基因表達的影響 對黃水蜜桃PBZ處理17 d后，通過葉面噴施GA3對其生長過程進行逆轉處理，對逆轉過程中GA合成代謝途徑相關基因表達水平變化進行測定。結果如圖5所示，在外源GA3處理后，黃水蜜桃嫩梢組織中與GA合成相關基因KO和GA20-ox的表達量在處理后8 h內均處于近乎不表達狀態，隨后其表達量逐漸上升，并于處理后6 d時達到峰值，此時KO基因表達量低于對照，而GA20-ox基因的表達量高于對照，隨后KO和GA20-ox基因的表達量逐漸下降，并在處理后12 d時均高于對照；GA3-ox基因在整個逆轉時期均處于近乎不表達狀態。與GA代謝相關基因GA2-ox的表達量在處理后8 h內逐漸升高，并在處理后3 d時達到峰值，此后表達量逐漸下降，而對照在整個逆轉時期均處于近乎不表達狀態。

圖4 逆轉處理后黃水蜜桃新梢生長變化Fig.4 Changes of shoot growth after reverse treatment on Huangshuimi

圖5 逆轉處理后GA合成代謝途徑中相關基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達量Fig.5 The expression of genes related to gibberellin biosynthesis pathway in shoot of Huangshuimi after reverse treatment

2.2.3 逆轉處理對黃水蜜桃GA信號轉導途徑相關基因表達的影響 在外源GA3逆轉處理后，對黃水蜜桃嫩梢組織中與GA信號轉導途徑相關基因的表達進行測定。結果如圖6所示，GID1c和ERF11基因在處理后8 h內處于近乎不表達狀態，隨后表達量逐漸升高，其表達量分別在處理后3，6 d時達到峰值，隨后表達量逐漸下降且高于對照，而對照處理中GID1c基因在整個時期內均處于近乎不表達狀態；DELLA和SLY1基因在處理后2 h內表達量處于下降趨勢，隨后表達量逐漸上升，DELLA基因表達量在處理后3 d時達到峰值但表達量低于對照，而SLY1基因的表達量在處理初期出現先下降后上升的趨勢，并于6 d時表達量達到峰值且表達量高于對照，DELLA和SLY1基因達到峰值后，均逐漸降低并于處理9 d后開始上升，最終表達量均高于對照。

圖6 逆轉處理后GA信號轉導途徑中相關基因在黃水蜜桃嫩梢中的表達量Fig.6 The expression of genes related to the GA signaling transduction pathway in shoot of Huangshuimi after reverse treatment

3 結論與討論

GA是重要的植物生長調節劑，其最為顯著的生理作用是促進植物的莖伸長生長；PBZ作為GA的抑制劑，可使新梢節間縮短，有效抑制果樹新梢的營養生長。劉芳等[7]于甜櫻桃品種紅燈新梢生長期分別對葉面噴施GA3和PP333，結果表明，GA3可明顯促進新梢生長而PP333顯著抑制新梢生長。本試驗中對黃水蜜桃進行外源GA3處理，結果表明，與對照相比桃嫩梢生長量增加，并在GA3處理后8 d時新梢凈生長量顯著高于對照；在PBZ處理后新梢凈生長量低于對照，其新梢凈生長量在處理后5，8，14 d時均顯著低于對照，并在處理后17 d時達極顯著水平。本研究結果與劉芳等[7]研究結果相似，GA3和PBZ處理分別對新梢生長表現出明顯的促進和抑制作用。Steffens等[29]通過對蘋果枝條進行外源PBZ處理，發現蘋果枝條生長受到抑制，節間長度變短，繼而噴施GA3后可在短期內使枝條恢復生長。本研究中在PBZ處理后17 d時對黃水蜜桃噴施外源GA3，發現可明顯解除PBZ對桃新梢生長的抑制作用，新梢凈生長量在處理后3,6 d時均顯著高于對照，表明外源GA3處理可有效逆轉PBZ對枝條生長的抑制作用，該結果與Steffens等[29]在蘋果試驗中結果一致。

GA合成代謝途徑中關鍵酶KO、GA20-ox、GA3-ox和GA2-ox對維持植物體內活性GA水平具有重要作用。Carrera等[13]研究發現，StGA20-ox蛋白在馬鈴薯ga1突變體葉片中高表達，表明GA20-ox受到植物內源活性GA的負反饋調節；Bidadi等[30]對擬南芥莖尖分別噴施GA3和GA合成抑制劑Uniconazole，發現GA3處理導致擬南芥初級根伸長不明顯，而Uniconazole處理后初級根明顯伸長，且GA20-ox和GA3-ox基因表達量增加，表明GA合成抑制劑的使用提高了活性GA的含量并啟動根的伸長；Wuddineh等[15]研究發現，過量表達PvGA2-ox5和PvGA2-ox9基因的轉基因柳枝稷(PanicumvirgatumL.)均表現出與GA缺陷型突變體類似的矮化表型，外源噴施GA后表型恢復。本試驗在對黃水蜜桃進行外源GA3處理后，GA合成相關基因KO和GA3-ox在嫩梢中的表達量在處理2 h后隨著處理時間的延長受到抑制作用，而GA20-ox基因在GA處理前期幾乎不表達，隨著外源GA3藥效減弱，KO和GA20-ox基因表達量在處理后14 d時高于對照，結合生長數據進行分析表明，外源GA3處理后GA合成相關基因參與GA負反饋調節；GA代謝相關基因GA2-ox表達量在外源GA3處理后前期近乎不表達，隨著處理時間的延長表達量逐漸升高并高于對照，表明外源GA3可促進GA2-ox基因的表達，即GA2-ox基因參與活性GA正反饋調節。該結果與GA3對PBZ逆轉處理過程中KO、GA20-ox、GA3-ox和GA2-ox基因表達量變化類似，且與前人在馬鈴薯[13]、擬南芥[31]中研究結果一致。上述研究結果表明，活性GA對GA合成代謝途徑中合成酶基因表達水平具有抑制作用，對GA合成代謝途徑中代謝酶基因表達水平具有促進作用。

GA信號轉導途徑在植物中行使作用的機制為：在植物體內活性GA水平較低的情況下，DELLA蛋白抑制GA效應來減少植物生長，而當植物體內活性GA水平較高時，GID1蛋白受體通過構象變化結合活性GA，之后與DELLA蛋白形成三聯體，最后DELLA蛋白被降解，解除對植物生長的抑制作用，開啟活性GA對植物生長的促進作用[32-33]。本試驗結果表明，在外源GA3處理后，嫩梢中DELLA、GID1c和SLY1基因在處理前期與對照類似均處于近乎不表達狀態，隨后表達量逐漸升高，在14 d時達到峰值且均高于對照；而在外源GA3對PBZ逆轉處理時期，DELLA蛋白基因和GID1c基因的表達與初處理中外源GA3處理的表達趨勢不一致，即在逆轉處理后其表達量先上升后下降，且在處理后12 d時DELLA蛋白基因和GID1c基因表達量均高于對照，該結果與Hollender等[26]在矮化桃中GID1c基因的研究結果相似。SLY1基因是GA信號轉導途徑中的正調控因子，在外源GA3處理后，該基因在桃嫩梢中表達量下調，并于后期迅速上升并高于對照；而在逆轉處理過程中該基因表達量在處理初期出現先下降后上升的趨勢，并于6 d時表達量達到峰值且高于對照；ERF11基因在外源GA3處理后其表達量在處理初期高于對照隨后下降且趨于不表達，在處理后8 d時逐漸升高并于14 d時達到峰值且高于對照，進一步印證了Zhou等[23]提出的ERF11對植物生長調節的作用機制。

PBZ是一種植物生長抑制劑，主要通過抑制植物頂端分生組織中GA的產生，從而抑制GA的生物合成[34]。呂文濤等[35]通過對朱頂紅品種孔雀花使用不同質量濃度PP333處理發現，300 mg/L PP333處理后可使植株矮化。本試驗在對黃水蜜桃進行外源PBZ處理后，與GA合成相關基因KO、GA20-ox和GA3-ox在嫩梢中的表達趨勢各不相同，且在處理后17 d時表達量均低于對照，結合生長數據進行分析，表明外源PBZ處理通過下調桃嫩梢中KO、GA20-ox、GA3-ox基因表達量調控枝條生長量，隨后進一步下調GA合成基因在不同組織中表達量對生長產生抑制作用，表明外源PBZ處理可抑制與GA合成相關基因(KO、GA20-ox和GA3-ox)的表達；與GA代謝相關基因GA2-ox在外源PBZ處理后初期與對照變化趨勢較為一致，在處理后11 d時表達量達到峰值且高于對照，隨著外源PBZ藥效減弱，于處理后17 d時表達量略低于對照，表明外源PBZ處理可抑制GA2-ox基因的表達；與GA信號轉導途徑相關基因(DELLA、GID1c、SLY1和ERF11)的表達量表現為在外源PBZ處理后，嫩梢組織在整個處理時期的表達量均低于對照，受到一定的抑制作用。綜上所述，推測外源PBZ處理在轉錄水平上通過抑制GA途徑中相關基因表達水平，從而降低GA信號轉導途徑的效率來行使對植物的生長調節作用。