河北省130份西瓜品種與種質資源抗病基因KASP檢測分析

張敬敬，張海英，潘秀清，許 勇，任 毅，高秀瑞，李 冰，史宇凡，黨繼革，楊明珠，武彥榮

(1.河北省農林科學院 經濟作物研究所，河北 石家莊 050051；2.北京市農林科學院 蔬菜研究中心，北京 100097；3.河北雙星種業股份有限公司，河北 石家莊 050061)

中國是世界上最大的西瓜種植國和消費國，每年的西瓜產量約7×103萬t[1]，河北省西瓜種植面積基本維持在6.67萬hm2，居全國第5位[2]。由于西瓜經濟效益高，生產區連年種植，連作障礙日益嚴重，造成西瓜枯萎病、炭疽病和白粉病等病害多發和重發，顯著降低了西瓜產量和品質，因此，選育優質單抗或多抗西瓜品種仍是河北省的重要目標。

由于常規育種具有操作簡單、選擇性狀綜合全面等優勢，目前仍是育種的主要方法，但常規育種易受環境和育種者的經驗影響，存在育種周期長、效率低等缺點[3]，尤其是田間抗病鑒定復雜，而多抗鑒定更難。近年來，隨著高通量測序技術的發展，由LGC公司研發的競爭性等位基因特異性PCR技術即KASP技術具有高度穩定性、準確性和高效性，逐漸被用于重要功能基因的SNPs和InDels檢測和重要性狀標記[4-8]，采用高通量分型KASP標記技術可同時鑒定多種病害，可加快西瓜抗病性育種步伐。

本試驗針對河北省西瓜枯萎病、白粉病和炭疽病等病害發生嚴重，生產中抗病西瓜品種缺乏等突出問題，利用許勇團隊開發的西瓜抗枯萎病、抗炭疽病和抗白粉病分子標記，對河北省130份西瓜品種和資源進行抗病性狀功能基因的KASP標記檢測，為準確評價西瓜品種和資源提供參考，以進一步提高河北省西瓜育種效率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以河北省近年來審(鑒)定西瓜品種和優勢組合(星研七號、美佳、美勝、貴妃、17-11等)以及優異種質資源共130份為試驗材料(表1)，以3抗302為抗病基因分子檢測的抗病對照，以GBZG為感病基因分子檢測的感病對照。

1.2 DNA的提取及檢測

取西瓜種芽放入加有鋼珠的2 mL離心管中，每個材料3次重復，采用CTAB法提取DNA(向樣品中加入100 μL CTAB，用組織打碎儀將種芽打碎后用離心機離心1 min(1 000 r/min)，加入400 μL CTAB后65 ℃水浴加熱30 min，加入三氯甲烷+異戊醇(24∶1)400 μL，4 ℃放置5 min，離心10 min(2 500 r/min)后取其上清液加入400 μL異丙醇，放入-20 ℃冰箱至少30 min，從冰箱取出后離心10 min(2 500 r/min)，將上清液倒出，向沉淀物中加入70%酒精100 μL，離心5 min(2 500 r/min)，倒出上清液，將沉淀物放入通風櫥風干，加入50 μL ddH2O，放入-20 ℃冰箱備用)，使用Thermo 公司生產的超微量分光光度計檢測DNA濃度。

1.3 KASP標記檢測

根據許勇團隊開發的西瓜抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病分子標記序列和上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成的抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病基因的KASP標記引物，使用LGC公司生產的KASP 平臺檢測。PCR反應體系為7.32 μL，包括1.5 μL DNA(2～10 ng/μL)，4.32 μL Master Mix，1.5 μL KASP Assay Mix。PCR反應程序：94 ℃預變性15 min；94 ℃ 20 s，61 ℃ 1 min，10個循環；94 ℃ 20 s，55 ℃ 1 min，26個循環。反應結束后熒光掃描，并進行基因分型分析。

1.4 西瓜苗期接種枯萎病、炭疽病、白粉病病菌試驗

西瓜枯萎病病菌生理小種、炭疽病病菌生理小種、白粉病病菌生理小種由北京市蔬菜工程中心許勇團隊惠贈，試驗于2018年10月在河北省農林科學院經濟作物研究所智能溫室中進行。

將130份試驗材料和抗病對照、感病對照于55 ℃溫湯浸種6 h后放置30 ℃恒溫箱中培養24 h，取出發芽整齊的種子播種至已滅菌的育苗基質中，覆蛭石澆水蓋膜保濕。

浸根接種枯萎病病菌：每份西瓜材料子葉展平期選取生長一致的幼苗30株，用清水洗凈根系，在濃度為106個/mL分生孢子懸浮液中浸根15 min，接種后將瓜苗移栽至滅菌的基質中，放在28 ℃環境中生長，3 d后調查枯萎病發病情況。西瓜枯萎病抗性標準、等級劃分和病情指數計算參照姬萬麗等[9]試驗方法。

噴霧法接種炭疽病病菌：西瓜幼苗長至2片真葉時，采用噴霧法于傍晚將濃度為106個/mL分生孢子懸浮液接種至西瓜葉片，每份材料接種30株，接種7 d后調查發病情況。參照崔召明等[10]方法的抗性標準、等級劃分和病情指數進行劃分和計算。

噴霧法接種白粉病病菌：于子葉展平期接種，用噴霧器將孢子懸浮液噴到葉片表面，每份西瓜材料接種30株。接種后保持溫度28 ℃/20 ℃(日/夜)，相對濕度約70%，接種12～15 d充分發病后，參照徐向麗等[11]方法計算病情指數。

2 結果與分析

2.1 西瓜種芽DNA質量濃度的檢測結果

使用Thermo公司生產的超微量分光光度計檢測提取好的西瓜種芽DNA濃度，用ddH2O稀釋使DNA質量濃度在2～10 ng/μL。

2.2 西瓜抗枯萎病、炭疽病、白粉病的KASP檢測結果和苗期接種結果

本研究根據許勇團隊提供的西瓜抗病分子標記，利用高通量KASP對河北省130份西瓜參試材料進行了抗枯萎病、抗炭疽病和抗白粉病性狀基因的KASP檢測，為驗證KASP引物的特異性及準確性，選取抗病材料3抗302和感病材料GBZG，檢測結果見圖1。由圖1可知，KASP標記檢測技術可以清晰地把上述抗病的2種基因型分開，三角形為抗病的純合型材料，五角星為感病的純合型材料，正方形為攜帶等位變異的雜合型材料，圓形為未檢出。

本試驗共檢測了3個抗病基因，包括抗枯萎病基因(Fon-1)、抗炭疽病基因(AR1)、抗白粉病基因(PM1)。結果顯示，Fon-1在供試材料中所占比例最大，有33份，占供試材料的25.38%，AR1在供試材料中有19份，占比14.62%，PM1在供試材料中有7份，占比5.38%，Fon-1和AR1同時在供試材料中有5份，AR1和PM1同時在供試材料中有1份，3種抗病基因同時在供試材料中有1份(表1、圖2)。

苗期接種試驗結果表明，130份供試材料抗枯萎病材料33份，其中中抗材料17份包括美勝、花早綠、貴妃等，輕抗材料16份包括0405-3、S67-M、S68-M等；抗炭疽病材料19份，中抗材料13份包括星研七號、雙星37、S67-M等，輕抗材料6份包括S64-M、SJL、力母等；抗白粉材料7份包括美佳、S66、901新等，中間類型材料23份包括ZH、S68-M、NDL等，苗期鑒定結果與KASP檢測結果相一致，均可為西瓜抗病育種提供參考。

根據KASP對西瓜抗病性狀基因的檢測結果，比對供試西瓜材料田間表現，抗枯萎病如貴妃、美勝、三白西瓜、花早綠、0412、0419等材料，此類型材料多晚熟，田間表現出生長勢強，后期不衰秧，西瓜品質中等偏上的特點；抗炭疽病如星研七號、雙星37、JB-1、LGZ、力母、力父等材料，此類型多晚熟，生長勢強，瓜的類型較多，品質中等偏上，四倍體材料多屬于這類；抗白粉病如美佳、901細花紅、901新、S66等材料，此類型與小果型西瓜有血緣關系的居多，具體表現生長勢中等，分枝性中等，果實品質較好；同時抗枯萎病和抗炭疽病2種病害材料包括F35板葉、S64-M、S67-M、0405-3、0406，此類型為中果型瓜，熟性較晚，生長勢強，不衰秧；同時抗炭疽病和抗白粉病2種病害材料LGZ，該材料為小果型瓜、長勢中庸、分枝性中等、葉片稀疏、較小、品質好；同時抗枯萎病、抗炭疽病和抗白粉病材料3種病害材料JB-3，田間表現為生長勢較強，不衰秧，單瓜質量3～4 kg，淺黃底色上有深黃色花條、圓瓜、紅瓤、質地沙，中心和邊緣可溶性固形物含量分別為10.5%和7.8%。上述材料在西瓜抗性育種中具有較大應用潛力，尤其是同時抗上述3種病害材料JB-3，可進一步加強對該材料的利用。

三角形.純合型基因抗病；五角星.純合型基因感病；正方形.雜合型基因；圓形.未檢出；A.枯萎病基因的KASP標記；B.炭疽病基因的KASP標記；C.白粉病基因的KASP標記。Triangle.Homozygous resistance gene； Pentagram.Homozygous susceptible gene； Square.Hoterozygous gene； Roundness.Not detected; A.KASP marker of Fusarium wilt gene； B.KASP marker of anthracnose gene; C.KASP marker of powdery mildew gene.

材料名稱Materialsname枯萎病Fusarium Wilt白粉病Powdery mildew炭疽病AnthracnoseKASP檢測苗期接種KASP檢測苗期接種KASP檢測苗期接種材料名稱Materialsname枯萎病Fusarium Wilt白粉病Powdery mildew炭疽病AnthracnoseKASP檢測苗期接種KASP檢測苗期接種KASP檢測苗期接種3抗302 3 kang 302R15.1HRR34.2RR6.2HR0414-1-1S90.2SS76.6SS68.3SGBZGS94.7SS79.7SS67.1S豐抗 FengkangS94.6SS77.5SR23.4MRS56-1S84.3SS78.3SR22.4MR0405-3R52.7LRS67.9SR20.9MRS57-1H80.5SS70.2SS60.8S美勝 MeishengR39.6MRS63.7SS64.3SS63-MH83.7SS86.5SS63.5S0423-1R41.7MRS73.2SS69.9SS64-MR52.1LRS83.4SR39.7LR西農橢 XinongtuoR44.7MRS70.0SS66.1S美佳 MeijiaS86.3SR21.1RS62.8SF35板葉 F35 banyeR38.9MRS67.6SR26.9MRS66S85.4SR30.4RS65.1S黃肉 HuangrouS92.4SS70.6SS76.5SS67-MR61.8LRS80.9SR24.2MRJB-1S95.5SH46.0MR22.7MRS68-MR67.4LRH56.0MS64.3SJB-3R40.1MRR26.8RR20.1MRS69-MR58.2LRS79.4SS61.9S雙星37 Shuangxing 37S86.1SS65.5SR18.9MRS70-MS90.8SS80.4SR20.8MRSJLR62.3LRS80.9SR39.2LRS71-MS95.2SS88.2SR18.6MRBLJM-1R53.3LRN49.2MS85.4SS72-MR60.6LRS71.9SS67.6SXC-1S96.1SS68.9SS88.9SS73-MS90.2SH48.1MH57.9S富士 FushiS90.3SS73.1SS90.0SS74-MS88.9SH53.3MN59.1SLXMN83.4SN43.7MN56.8SS80-MS96.1SN56.7MN58.5S(901)6-1-MN81.6SN56.6MN57.4SS85S95.7SS66.9SR25.3MRLDS95.3SS70.2SS90.1SS75R56.8LRS63.5SS60.9S花早F2-4 Huazao F2-4S94.4SS63.7SS63.3S秀麗F2-1-2 Xiuli F2-1-2S93.7SS67.1SS62.8SLYLR66.1LRS66.4SS70.6S全霜99F2-1-1Quanshuang 99F2-1-1S97.1SS72.4SS70.9S日引1-3-1-3Riyin 1-3-1-3R39.5MRS63.9SS65.6SBSH-1-1-1-2S88.9SS80.9SH59.7S花早綠 HuazaolüR38.4MRS61.5SS60.2S901新901xinS85.0SR20.5RS72.5S三白西瓜Three white watermelonR37.7MRS65.9SS64.3S日引1-3-1-2Riyin 1-3-1-2R39.7MRS72.3SS71.8SKB1MR65.6LRS74.6SS86.7SS84-1-MS96.8SH56.7MS77.3SKB2MR61.1LRS72.3SS88.7SS65S95.7SH49.6MS70.4SKBFS89.7SN57.9MS84.3貴妃 GuifeiR37.5MRS80.3SS75.1STZ6R51.7LRS68.8SS86.5S43451S88.7SH57.3MS72.3S農大S7 Nongda S7N82.5SN55.1MN59.1S903R42.5MRS76.6SS74.6S西農F1-2-MR40.6MRN56.3MS56.7S Xinong F1-2-M早系1-1 Zaoxi 1-1S90.4SS82.1SS68.4S0402N83.1SH47.7MH60.7SNDLR56.9LRH45.5MS59.8S0403R40.9MRS74.9SS79.6S88-2-2-5S93.4SR23.9RS67.5S星研七號 Xingyan No.7S88.8SS83.1SR22.6MR花早 HuazaoS90.6SH46.1MS65.9S0408S93.4SS80.2SR36.4LRXC2-1S89.1SN49.9MN59.9S901細花紅 901 xihuahongS90.5SR33.4RS60.3SZY10S85.4SS86.3SH56.6S0410R46.1MRS61.8SS75.4SZHN85.2SH54.2MN60.1S0412R44.4MRH56.6MS72.5SW89S96.9SH53.8MR35.6LR0415S93.7SS70.7SH60.4S力母 LimuS92.1SS82.5SR35.1LR0419R46.7MRS71.9SS70.0S力父 LifuS92.4SS73.3SR32.7MR0420S95.6SS73.2SS69.8SLGZS95.7SR36.6RR40.5LR0422S94.9SS66.6SS73.6S0418-3-1S97.6SS64.9SN58.3S0424R65.3LRS68.4SS68.4SCXF-2-5S94.4SS69.9SS70.3S0425S94.5SS69.1SS72.1S小天使 XiaotianshiS90.2SS75.5SH60.8S齊抗 QikangR42.8MRS76.0SS63.8S

注：R.抗病；S.感??；H.雜合位點抗病；N.未檢測出；HR.高抗；MR.中抗；LR.輕抗；M.中間類型。

Note： R.Resistant; S.Susceptible; H.Resistant at heterozygous sites; N.Not detected; HR.High resistant; MR.Middle resistant; LR.Light resistant; M.Middle style.

圖2 西瓜抗病占比Fig.2 Disease resistance rate of watermelon

2.3 以KASP檢測結果為基礎的聚類分析

以抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病KASP檢測結果顯示抗病、感病、雜合抗性和無檢測信號4種結果為依據，將130份西瓜材料與抗病對照、感病對照分為4大類群(圖3)。第1類有12份材料，為不抗白粉病材料，其中7份為感枯萎病材料，5份為抗枯萎病且感炭疽病材料；第2類有67份材料，為抗白粉病或同時感2種病害材料，其中7份材料抗白粉病，60份為同時感2種病害材料；第3類有38份材料，為枯萎病、炭疽病單抗或多抗材料，其中11份為單抗炭疽病材料，5份為同時抗炭疽病、抗白粉病材料，22份為單抗枯萎病材料；第4類有13份材料，在抗枯萎病、抗炭疽病或抗白粉病基因方面均無檢測信號或雜合抗性，其中2份為感枯萎病且在抗白粉病和抗炭疽病基因處無檢測信號，6份為感枯萎病且在抗白粉病或抗炭疽病基因處無檢測信號或雜合抗性，5份為抗枯萎病、抗白粉病和抗炭疽病基因處均無純合基因檢出。

3 結論與討論

3.1 抗病性檢測分析及高通量分子檢測應用

植物分子抗病性檢測方法被廣泛應用，如西瓜枯萎病檢測方法中曹月霞等[12]建立了雙重PCR檢測體系，通過設計和應用引物Fon-2R/Fon-2F、Fon-3R/Fon-3F、Fon-4R/Fon-4F和Fon-6R/Fon-6F，采用電泳方法能檢測出西瓜枯萎病菌。西瓜炭疽病檢測中唐建輝等[13]利用2對引物CY1/CY2和SCAR 引物RB/RC組成雙重 PCR 檢測體系，并且能夠直接在植物組織中將西瓜炭疽菌 (C.orbiculare) 檢測出來。劉易科等[14]選用52個小麥抗赤霉病、條銹病、白粉病和紋枯病的基因(QTL)的功能標記或連鎖標記對其進行分子鑒定和分析。本試驗利用許勇團隊研究的西瓜抗枯萎病[15]、抗炭疽病、抗白粉病[16]分子標記和KASP分型標記對130份西瓜材料進行抗病性分型檢測，KASP標記具有快速、高效的特點。

圖3 西瓜KASP結果聚類分析Fig.3 Analysis diagram of watermelon KASP results

徐平麗等[17]利用TaqMan 探針標記與 KASP 分子標記鑒別花生后代籽粒AhFAD2B基因的基因型，進而選育高油酸花生品種，大大減少了田間選擇的工作量，提高了回交選育高油酸花生的效率；趙勇等[5]采用測序法、酶切擴增多態性序列法(CAPS)和競爭性等位基因特異性 PCR (KASP)法對大豆Dt1基因的4個 SNP 進行分型，結果表明，KASP 法準確率達94.3%，同時KASP具有快速、高效的特點；楊子博等[6]為了解江蘇淮北地區小麥品種資源的籽粒硬度概況及硬度基因型分布規律，以74份近年來江蘇淮北地區所育品種(系)和38份來自黃淮其他麥區的常用親本為材料，采用單籽粒谷物硬度測試儀、KASP標記檢測技術和基因擴增及測序技術對其SKCS硬度值及硬度基因型進行鑒定。張宏軍等[18]利用小麥抗赤霉病Fhb1基因的 KASP 標記在回交后代中進行基因型分析，分別選擇攜帶和不攜帶Fhb1基因的可育株, 對后代株系進行單花滴注接種鑒定和田間病圃自然鑒定，利用Fhb1基因分子標記輔助選擇技術能夠有效地提高黃淮冬麥區小麥品種的赤霉病抗性水平。Awais Rasheed[19]開發并鑒定了一批與普通小麥適應性、產量、品質、生物和非生物脅迫抗性相關的KASP標記，研究表明，KASP標記的檢測效率是基于凝膠的傳統PCR標記的45倍。目前，KASP標記已發展為一種單基因高通量基因型檢測技術，本試驗利用西瓜抗枯萎病基因Fon-1、抗炭疽病基因AR1、抗白粉病基因PM1的KASP標記，對130份材料進行基因型分析，分為純合位點抗病、雜合位點抗病、純合位點感病和未檢出，與室內接種結果相一致，該方法可作為高通量SNP標記的補充，有效促進雜交親本和高代品系的鑒定，提高西瓜育種效率。

3.2 聚類分析及以KASP為基礎的聚類分析應用

聚類分析方法在作物育種中應用廣泛。金鳳媚等[20]通過測定番茄品質特性的遺傳多樣性和分子標記的多態性，對番茄品種資源進行了聚類分析，聚類分析是鑒別品種資源遺傳差異程度、篩選核心資源的有效手段。劉亞利等[21]以5個玉米自交系為測驗種，按NCⅡ遺傳交配設計配制55個測交組合，進行產量配合力效應及聚類分析。根據產量SCA進行聚類分析，可將16個自交系分為5類。楊志剛等[22]以92份辣椒資源為材料，分別對辣椒色價值和辣椒單果質量、果肉厚、果實縱橫徑進行聚類分析，從中篩選干制紅辣椒的優良種質材料。前人采用聚類分析法對番茄[20]、辣椒[22]、玉米[21]等作物進行分類，本試驗基于西瓜抗枯萎病、炭疽病和白粉病的KASP檢測結果，采用Ward離差平方和法對西瓜進行抗病性差異聚類分析，把130份材料分為4類，第1類有12份材料，為不抗白粉病材料；第2類有67份材料，為抗白粉病或同時感2種病害材料；第3類有38份材料，為枯萎病或炭疽病單抗或多抗材料；第4類有13份材料，為不抗枯萎病、炭疽病和白粉病材料。利用KASP分子標記進行聚類分析，分類結果更加科學可靠, 對于鑒別種質資源具有指導意義。

3.3 KASP檢測結果應用

高通量分型KASP標記檢測西瓜抗病性與苗期抗病鑒定結果一致，該技術具有高速高效準確特點，未來可利用該技術加快育種進程。利用KASP分子標記篩選出的同時抗3種病害的材料JB-3，田間表現生長勢較強，不衰秧，單瓜質量3～4 kg，中心和邊緣可溶性固形物含量分別為10.5%和7.8%。該材料在果實品質、耐低溫弱光方面表現不理想，但由于JB-3可同時抗枯萎病、抗炭疽病和抗白粉病，未來可通過回交轉育、定向選育方法培育出優質多抗西瓜新品種。