身痛逐瘀湯對大鼠中重度退變腰椎間盤髓核內TNF-α、IL-1β 的影響*

佟德民 孫鳳杰 馮福盈 倪東旭

（廣州醫科大學附屬第五醫院，廣東 廣州 510700）

中重度腰椎間盤退變性疾病是中老年人常見病，雖然其病理機制尚未完全闡明，但退變椎間盤內穩態持續紊亂可能是導致椎間隙狹窄、脊椎骨質增生骨贅形成等病變的始發因素和主要原因。既往研究發現，椎間盤退變過程中釋放的大量炎性因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等能促進纖維環周緣致敏疼痛神經末梢和新生血管向椎間盤內部長入而引發腰痛，因此抑制退變椎間盤內炎性因子的表達可能成為延緩椎間盤退變、減輕腰痛的有效方法。我們在前期研究發現，應用身痛逐瘀湯能顯著改善中重度椎間盤退變性疾病患者腰痛和肢體功能，臨床療效滿意［1］。本研究擬觀察身痛逐瘀湯治療中重度大鼠退變椎間盤髓核內TNF-α、IL-1β表達變化，進一步揭示其可能的止痛機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3月齡清潔級雄性SD大鼠128只，體質量250～300 g，由廣東省動物實驗中心提供，合格證號：SGXK（粵）2008-0002。 飼養室溫度 20～25 ℃，相對濕度為56%～64%。動物自由進食，自由飲水。所有動物在實驗前適應環境7 d。

1.2 試藥與儀器 1）實驗試劑及藥物：TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒（R&D，美國）。身痛逐瘀湯出自《醫林改錯》，藥方組成：秦艽3 g，桃仁9 g，紅花9 g，當歸 9 g，川芎 6 g，沒藥 6 g，五靈脂 6 g，羌活 3 g，地龍6 g，香附3 g，牛膝9 g，甘草6 g。飲片購買于廣州醫科大學附屬第五醫院。身痛逐瘀湯煎煮方法：加水500 mL，浸泡 30 min，煮沸后文水煎煮 30 min，取汁300 mL；再加水400 mL，煮沸后文水煎煮20 min取汁200 mL，兩次煎液混合后濃度為1.5 g/mL，保存于恒溫冰箱中備用。尼美舒利分散片（海南康芝藥業股份有限公司生產，批號 160503，規格為 50 mg/粒）。 2）儀器：CM1900冰凍切片機、RM2015石蠟切片機、ASP200S自動組織脫水機（Leica公司，德國），CT15ER高速冷凍離心機 （日立公司，日本），KH-BL石蠟包埋機（Olympus公司，日本）。

1.3 造模與分組 按照隨機數字表法將128只SD大鼠分為假手術組、模型組、西藥組和中藥組，每組32只。模型組、西藥組和中藥組接受手術造模，假手術組接受假手術。手術造模方法［2］：隔夜禁食后，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射。動物麻醉后，仰臥位四肢固定，術區剃毛，碘伏消毒，取右側旁正中切口長約3～4 cm，依次切開各層組織，向前側、對側推開腸管及大網膜，鈍性分離椎體旁側束帶狀腰大肌，顯露L4/5～L5/6椎間盤，選擇16 G針頭針刺椎體右前側纖維環（3點位置），朝向椎間盤中心，限制損傷深度為纖維環全層（約為2～3 mm），損傷后持續留置10 s，術后逐層縫合創口。假手術組依照上述入路操作，但不進行椎間盤針刺操作。術后連續3 d肌注青霉素8×105U/d以預防感染。術后常規飼養。術后第8周，每組各隨機選取8只予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，麻醉后行腰椎側位X線檢查。耳源靜脈注射空氣處死，獲取大鼠手術椎間盤后，ELISA檢測TNF-α和IL-1β含量。腰椎側位DR檢查示造模后大鼠腰椎間隙高度降低，椎體前緣骨贅形成，部分終板硬化，參照UCLA［3］分級系統評價椎間盤退變程度為Ⅲ°～Ⅳ°，確定造模成功。

1.4 干預方法 參照不同動物等效劑量的折算系數，身痛逐瘀湯藥方內單劑含生藥75 g，計算得出中藥組大鼠灌胃量為4.5 mL/kg，假手術組和模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，西藥組予尼美舒利分散片灌胃，量為0.18 mg/kg，每日1次，連續喂養20 d。分別于喂養后、喂養后2周和喂養后4周每組各隨機選取8只大鼠處死，獲取椎間盤髓核組織。

1.5 標本采集與檢測 各組大鼠髓核組織采用PIPA裂解液裂解，離心半徑13.5 cm、2 500 r/min離心20 min。取上清液，參照試劑盒說明書測定TNF-α和IL-1β含量，結果以ng/L來表示。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，與假手術組比較用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組不同時間大鼠椎間盤髓核組織TNF-α水平比較 見表1。喂養前，模型組、西藥組及中藥組與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），該3組互相比較，差異無統計學意義（P>0.05）。喂養后，模型組、西藥組及中藥組與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），西藥組和中藥組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），西藥組和中藥組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。喂養后2周，模型組、西藥組及中藥組與假手術組比較，差異有統計學意義 （P＜0.01），西藥組和中藥組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），西藥組和中藥組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。喂養后4周，模型組、西藥組及中藥組與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），西藥組和中藥組與模型組比較，差異有統計學意義 （P＜0.01），西藥組和中藥組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。假手術組喂養后各個時間點與喂養前比較，差異無統計學意義（P>0.05），模型組喂養后各個時間點與喂養前比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），西藥組喂養后2周與喂養前比較，差異無統計學意義（P>0.05），中藥組喂養后各時間點與喂養前比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組不同時間大鼠椎間盤髓核組織TNF-α水平比較（ng/L，x±s）

表1 各組不同時間大鼠椎間盤髓核組織TNF-α水平比較（ng/L，x±s）

與本組喂養前比較，*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05；與模型組比較，◇P＜0.01；.與西藥組比較，☆P＜0.05。 下同

組 別 n 喂養前 喂養后 喂養后2周 喂養后4周假手術組 8模型組 8西藥組 8 4.09±0.72 4.13±0.70 4.47±0.64 4.58±0.66 10.29±0.84△ 13.04±0.34*△ 13.8±0.40*△ 14.73±0.53*△10.31±0.85△ 7.62±0.87*△◇ 9.73±0.67△◇ 11.77±0.85*△◇中藥組 810.23±0.89△ 7.73±0.93*△◇ 8.86±0.94*△◇☆ 9.23±0.93*△◇☆

2.2 各組不同時間大鼠椎間盤髓核組織IL-1β含量比較 見表2。在喂養前后各時間點，模型組、西藥組及中藥組與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。喂養前，模型組、西藥組及中藥組互相比較，差異無統計學意義（P>0.05）。喂養后，西藥組及中藥組與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。喂養后，西藥組和中藥組比較，差異無統計學意義 （P>0.05）。喂養后2周和4周，西藥組和中藥組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。假手術組喂養后各個時間點與喂養前比較，差異無統計學意義（P>0.05），模型組喂養后各個時間點與喂養前比較，差異具有統計學意義（P＜0.01），西藥組喂養后及喂養后4周與喂養前比較，差異有統計學意義（P＜0.05），喂養后2周與喂養前比較，差異無統計學意義（P>0.05），中藥組喂養后各時間點內椎間盤髓核IL-1β含量呈緩慢增高趨勢，差異無統計學意義（P>0.05），但喂養后各時間點與喂養前比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組不同時間大鼠椎間盤髓核組織IL-1β水平比較（ng/L，x±s）

表2 各組不同時間大鼠椎間盤髓核組織IL-1β水平比較（ng/L，x±s）

組 別 n 喂養前 喂養后 喂養后2周 喂養后4周假手術組 8模型組 8西藥組 8 2.29±0.38 2.34±0.41 2.35±0.40 2.41±0.44 7.37±0.71△ 9.73±0.55*△ 10.11±0.62*△ 12.23±0.77*△7.38±0.81△ 5.87±0.54*△◇ 7.13±0.67△◇ 8.26±0.61*△◇中藥組 87.34±0.78△ 5.85±0.52*△◇ 6.03±0.47*△◇☆ 6.57±0.61*△◇☆

3 討 論

椎間盤內環境紊亂是誘導致敏神經纖維末梢和伴行新生血管沿著纖維環裂隙長入退變椎間盤內部而引起椎間盤退變性腰痛的基本病理機制［4-5］，雖然椎間盤退變是多因子及通路協同作用的復雜過程，但炎性因子發揮了重要作用。研究發現侵入椎間盤內的單核細胞和巨噬細胞釋放大量炎性因子［6］，包括白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）及TNF-α等能調節椎間盤退變的啟動和發展［7］。動物和人體實驗均已證實老化和退變性椎間盤內IL-1和TNF-α水平升高，TNF-α與椎間盤的突出和神經激惹相關，TNF-α抑制劑是下腰痛重要的調節因子［8-9］，而IL-1的調控直接促進細胞外基質合成下降和基質降解增加而加速椎間盤退變［10］。Krock等研究發現退變椎間盤內含有高表達的IL-1β、TNF-α、神經生長因子（NGF）及腦源性神經生長因子（BDNF）［11］。 Binch 等對術中切除的病變椎間盤和對照正常間盤內的神經營養因子及其受體、神經肽及血管源性因子基因檢測后發現，椎間盤退變過程中細胞因子釋放尤其是IL-1β能顯著增加NGF和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，推測炎性因子可能通過刺激退變椎間盤細胞釋放神經營養因子和神經遞質的方式誘導致敏神經纖維末梢及新生血管的長入以促進椎間盤退變和腰痛發生［12］。因此，抑制椎間盤內炎性因子的表達可能成為延緩椎間盤退變、緩解腰痛的有效方法之一［13-14］。

腰椎椎管狹窄癥、退變性腰椎滑脫癥及腰椎骨質增生癥等椎間盤退變性疾病是中老年患者的常見多發病，共同病理基礎是中重度椎間盤退變及繼發生物力學變化，主要表現為腰腿部疼痛麻木及肢體功能障礙［15］，嚴重影響中老年日常生活，增加了醫療和社會負擔。非甾體類消炎止痛藥是目前治療椎間盤退變性疾病的常用藥，限于其消化道及心血管系統等不良反應［16］，臨床應用受到限制。身痛逐瘀湯是王清任以“瘀血致痹”理論基礎設立的活血化瘀法代表方劑，功用為行氣活血、祛瘀通絡、通痹止痛，多用于瘀血痹阻、經絡失和所致的局部或周身疼痛，在脊柱退變性疾病治療上取得了滿意的臨床效果。現代醫學研究發現身痛逐瘀湯能改善組織氧供和局部缺血、增加神經血運以促進變性神經纖維恢復及減輕結締組織形成，具有顯著抗炎止痛作用。王志福等研究發現身痛逐瘀湯可抑制神經痛大鼠的痛敏反應，改善患側后肢運動功能，推測可能與降低脊髓神經炎癥反應有關［17］。馮宇等對延遲性肌肉酸痛癥大鼠研究后發現身痛逐瘀湯可以降低模型大鼠骨骼肌微損傷程度并抑制炎癥因子的釋放［18］。本實驗發現西藥組、中藥組與模型組比較喂養后各時間點TNF-α和IL-1β含量均明顯下降，說明西藥和中藥均有明顯抗炎作用。喂養后2周和喂養后4周，西藥組和中藥組內TNF-α和IL-1β含量均呈緩慢增高趨勢，西藥組喂養后2周與喂養前比較TNF-α和IL-1β含量未見明顯差異，喂養4周與喂養前差異明顯，表明西藥組停止喂養2周后髓核內炎癥水平已經恢復至喂養前狀態，停止喂養后4周炎癥水平呈顯著升高趨勢，但與模型組比較髓核內炎癥因子水平仍顯著降低，表明非甾體類消炎止痛藥僅能在一定程度上減輕退變椎間盤的炎癥狀態，短期療效滿意。中藥組在喂養后各時間點與喂養前比較炎癥因子表達均顯著降低，與西藥組比較停止喂養后2周和4周中藥組髓核炎癥因子降低更為明顯。李繼超等研究發現身痛逐瘀湯和非甾體類消炎止痛藥均能顯著降低膝骨性關節炎（痰瘀互結證）患者關節液和血清中IL-1β水平，但身痛逐瘀湯在改善IL-1β水平、血液流變學指標及膝關節功能評定方面明顯優于西藥組［19］。這與我們實驗結論是一致的，證明身痛逐瘀湯發揮了更穩定更持久的抗炎效果。

身痛逐瘀湯在內環境紊亂和外部力學趨于穩定的椎間盤退變末期明顯降低了中重度退變椎間盤髓核內TNF-α和IL-1β的表達，表現出穩定可靠的抗炎止痛作用，但具體作用機制尚有待進一步研究。