茯苓四逆湯對膿毒癥大鼠心肌保護機制的研究*

王 評 彭曉洪 黃永蓮 黃亞秀 李少萍 曹齊鳳 陳冬杰 胡世平

（廣東省深圳市龍崗區中醫院，廣東 深圳 518172）

膿毒癥是臨床急危重癥，是臨床危重癥患者的主要死亡原因之一［1-2］。心肌抑制是膿毒癥或膿毒癥休克最常見的并發癥之一，其發生率高達50%，其死亡率達70%～90%，而無心臟受累的膿毒癥患者死亡率只有20%，是造成膿毒癥預后不良的重要原因之一［3］。膿毒癥心肌抑制對人類健康構成嚴重威脅，且醫療費用較高，給社會、家庭帶來巨大的經濟負擔。有效預防和治療膿毒癥過程中出現的心肌損傷是膿毒癥治療的重要組成部分［4］。關于膿毒癥心肌抑制的發病機制尚不完全明確，目前相關的學說主要涉及心肌缺血和微循環功能障礙、內皮功能障礙、線粒體損傷、炎癥反應等［5-6］。心型脂肪酸結合蛋白（H-FABP）是反映心肌損害的理想生化標志物，H-FABP與當前診斷心肌損傷的“金標準”肌鈣蛋白有著更好的敏感性［7］。而且在心肌損傷的可逆性期，H-FABP的檢測性要優于超敏肌鈣蛋白［8］。茯苓四逆湯見于《傷寒論》，是溫陽育陰、活血利水的代表方。本研究通過制造膿毒癥大鼠模型，研究茯苓四逆湯對膿毒癥心肌抑制的作用，并探討其對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、H-FABP 的影響，探討茯苓四逆湯治療膿毒癥心肌抑制的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠100只，質量（200±30）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 藥劑與儀器 茯苓四逆湯由北京中醫藥大學深圳醫院中藥房煎制，茯苓四逆湯中茯苓30 g，熟附子10 g，黨參5 g，干姜8 g，炙甘草10 g。大鼠灌胃劑量參照血清藥理學等效劑量換算公式進行換算，成人茯苓四逆湯用藥量為1.05 g/（kg·d），成人到大鼠的換算系數Rab=6.17，則200 g大鼠的等效劑量折算為1.3 g，低、中、高劑量分別為 1 倍（1.3 g/d）、2 倍（2.6 g/d）、3倍（3.9 g/d）等效劑量作為大鼠灌胃給藥劑量。TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒 （美國R＆D公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術公司）、PCR儀（美國Perkinelmer公司），紫外凝膠成像系統、蛋白電泳儀、電轉儀、雜交箱和酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組與造模 SPF級SD雄性大鼠100只，適應性飼養3 d，按隨機數字表法分為以下5組：假手術組，膿毒癥組，茯苓四逆湯低劑量組，茯苓四逆湯中劑量組，茯苓四逆湯高劑量組。大鼠模型建立膿毒癥模型：通過盲腸結扎穿孔術（CLP）法，誘導制造動物模型［9］。腹腔注射0.4 mL/kg 10%水合氯醛，待麻醉滿意后，將大鼠固定于手術臺，常規消毒胸腹部皮膚，劍突下約2 cm處沿腹正中線剪開腹壁約1 cm，找出盲腸，用5號線結扎約1/3盲腸，用21G針頭貫通穿刺結扎部位的盲腸2次，輕輕擠壓使少量腸內容物溢出，將處理好的盲腸回納入腹腔，縫合腹腔。術畢，頸后皮膚常規消毒后皮下注射10 mL 0.9%氯化鈉注射液進行液體復蘇，麻醉蘇醒后單籠飼養。假手術組模型：對試驗大鼠開腹，取出盲腸，不結扎和穿孔，術后還納盲腸并關腹。待大鼠蘇醒后自由飲水正常進食，單獨飼養。6 h后除對照組外其余各組按照分組進行給藥，假手術組及膿毒癥組灌胃0.9%氯化鈉注射液，其余各組灌胃加味茯苓四逆湯。每天觀察大鼠的生存狀態和生存時間。分別在術前及術后24 h、48 h、72 h 3個時間點選5只大鼠尾靜脈取血并處死，取心肌組織后超低溫保存備用，測定 TNF-α、IL-6、H-FABP 水平。

1.4 標本采集與檢測 1）TNF-α和IL-6的測定。收集各組大鼠尾靜脈血8 mL，4 000 r/min離心10 min，留取上層血清并分置于EP管中，采用ELLISA法檢測血清中的TNF-α和IL-6的含量，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELLISA試劑盒說明進行操作，完畢后用全自動酶標儀在450 nm波長讀取吸光度值，繪制標準曲線，根據各標本吸光度值在標準曲線上得出相應的濃度。2）FABP的測定。收集各組心肌細胞，充分裂解后，離心5 min取上清液，取部分上清蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。然后每組取10 μL樣品以及蛋白標準物點樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90 V，觀察Marker的移動情況，適時終止電泳。轉膜、封閉、洗膜，切割后分別與其特定的稀釋過的一抗4℃雜交過夜，然后用TBST洗膜3次，與二抗反應至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機檢測。1.5 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 膿毒癥組大鼠術前24 h有3只大鼠死亡，飲食飲水減少，呼吸頻率加快，毛發蓬松無光澤，大便稀軟等癥狀。術后癥狀慢慢改善。低、中、高劑量組也出現膿毒癥組的表現，但無大鼠死亡，且給藥后癥狀較膿毒癥組減輕。假手術組大鼠飲食飲水均正常，手術前48 h活動量下降，后恢復正常。

2.2 各組TNF-α、IL-6檢測結果比較 見表1～表2。除假手術組外，其他4組大鼠血清TNF-α、IL-6水平含量于手術后均明顯升高，與假手術組差異有統計學意義（P＜0.01）；隨著時間增加，TNF-α、IL-6 含量逐漸降低；同一時間，中藥各劑量組與膿毒癥組在不同時間點的血清TNF-α、IL-6水平差異有統計學意義（P＜0.01）；不同劑量治療組中比較發現，劑量越高，其TNF-α、IL-6水平降低得越明顯（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各組不同時間點IL-6水平比較（x±s）

表1 各組不同時間點IL-6水平比較（x±s）

與假手術組同時間點比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與膿毒癥組同時間點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與低劑量組同時間點比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與中劑量組同時間點比較，◇P＜0.05。下同。

組 別 n假手術組 5膿毒癥組 5低劑量組 5術前 術后24 h 術后48 h 術后72 h 197.35±6.0 188.35±7.9 186.61±5.5 194.45±8.3 191.86±9.4 585.22±31.5** 455.07±15.4** 374.71±12.7**188.92±12.9 472.6±16.3**△△ 377.47±15.7**△△ 300.9±25.0**△△中劑量組 5 189.82±8.3 361.48±12.4**△△# 294.35±14.5**△△#266.45±18.9**△△#高劑量組 5 187.08±10.8 291.34±14.6**△△##◇ 255.88±8.2**△△##◇ 212.76±26.5**△△##◇

2.3 各組H-FABP檢測水平比較 見表3。除假手術組外，其他各組大鼠血清H-FABP水平含量于手術后均明顯升高；膿毒癥組和中藥各劑量組H-FABP在造模后明顯表達量上升且和假手術組差異有統計學意義（P＜0.01），隨著時間增加，含量逐漸降低；同一時間，治療組與膿毒癥組在不同時間點的血清H-FABP水平差異有統計學意義（P＜0.05）；不同劑量治療組中比較發現，隨著時間的延長，劑量越高的茯苓四逆湯對于改善H-FABP水平越好。

表2 各組不同時間點TNF-α水平比較（x±s）

表2 各組不同時間點TNF-α水平比較（x±s）

組 別 n假手術組 5膿毒癥組 5低劑量組 5術前 術后24 h 術后48 h 術后72 h 191.04±10.3 191.7±6.1 193.1±18.1 195.2±11.8 183.5±10.8 677.8±62.7** 527.0±40.3** 409.6±52.8**189.3±20.2 585.9±43.0**△△ 477.7±32.4**△△ 381.4±20.6**△△中劑量組 5 184.3±23.0 486.2±25.3**△△# 395.4±22.4**△△# 284.1±26.9**△△#高劑量組 5 183.0±12.4 422.8±32.0**△△##◇ 342.2±32.8**△△##◇ 228.0±33.0**△△##◇

表3 兩組不同時間點H-FABP水平比較（x±s）

表3 兩組不同時間點H-FABP水平比較（x±s）

組 別 n假手術組 5膿毒癥組 5低劑量組 5術前 術后24 h 術后48 h 術后72 h 1.52±0.02 1.63±0.01 1.59±0.02 1.62±0.10 1.53±0.01 3.69±0.26** 3.35±0.12** 2.31±0.14**1.62±0.01 3.52±0.13**△ 3.04±0.24**△ 2.22±0.34**中劑量組 5 1.65±0.01 3.39±0.22**△ 2.87±0.31**△ 1.95±0.17*高劑量組 5 1.67±0.02 2.96±0.15**△△# 2.44±0.21**△△# 1.66±0.02△△#◇

3 討 論

膿毒癥是指各種致病微生物侵入機體致感染后引起的全身炎癥反應綜合征，是創傷、燒傷、休克、感染和大手術等臨床急危重癥患者的嚴重并發癥之一，嚴重者可進一步發展為嚴重膿毒癥、膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征，是臨床危重癥患者的主要死亡原因之一［10］。在膿毒癥的發病過程中，心臟、肺臟和腎臟是最常見和最容易受影響的臟器器官。膿毒癥的本質是過度反應的全身炎癥綜合征，TNF-α、IL-6是全身炎癥時候細胞分泌的重要炎癥介質，并且目前的相關動物實驗研究發現TNF-α可以促進心肌炎性改變以及心肌細胞的凋亡從而引起心臟功能障礙［11］。H-FABP是一種可溶性蛋白，主要分布于脂肪酸代謝旺盛的組織，其在心肌組織中的含量是骨骼肌的10倍［12］。在正常生理情況下，心型脂肪酸結合蛋白參與心肌細胞的脂肪酸轉運及能量代謝，在維持心肌的存活和正常功能中發揮重要作用［13-14］。而當心肌細胞出現損傷時，能量代謝出現紊亂，心型脂肪酸結合蛋白可透過細胞膜大量釋放于組織間，因此其對于心肌損傷有著極高的敏感性［15］。

通過本實驗可以發現，在造模成功24 h后TNF-α、IL-6的水平達到最高水平，其后開始出現下降趨勢，且同時期H-FABP水平也在造模成功后24 h達到最高峰，并隨著時間的延長逐漸下降，而在假手術組中，大鼠的TNF-α、IL-6水平并沒有升高，而且同時其H-FABP水平也未出現明顯變化，證明了出現全身炎癥反應時，心肌細胞會受到抑制并出現損傷，該結果與國內相關研究結果相一致［16］。并且通過對比膿毒癥組和各劑量中藥組可以發現，茯苓四逆湯能夠有效降低TNF-α、IL-6及 H-FABP水平。

對于茯苓四逆湯降低H-FABP水平的機理，結合本實驗其他的結果，可以猜測出是由于茯苓四逆湯能夠通過抑制炎癥反應，減少炎癥因子的生成，從而直接損害心肌細胞。目前國內外對于炎癥因子如何造成心肌損害的機理尚未明確，因此本實驗仍需進一步研究其內在機理，為明確茯苓四逆湯保護心肌抑制的分子途徑提供證據。

綜上，茯苓四逆湯能夠有效抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應，并且對于心肌抑制也起到保護作用，其機理可能與通過抑制炎癥反應，減少炎癥因子生成相關。