一例豬圓環病毒感染的PCR診斷及病案分析

潘淑惠，王 璇，吳玙彤，文正常＊

（貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005）

豬圓環病毒(Porcine circovirus，簡稱PCV)感染發病最早發現于加拿大(1991)，很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發生和流行。現已知PCV有2個血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2為致病性病毒，它是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,簡稱PMWS)的主要病原。除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病，亦與PCV2感染有重要關聯。現已被世界各國公認為是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發現的一種豬免疫障礙重要傳染病。2018年7月，貴州地區某縣一地方黑毛豬養殖場，發生了一起商品豬以重度局灶性皮炎、皮下淺表淋巴結腫大為典型臨床病理特征的傳染性疾病，采集病料經實驗室PCR特異性鑒別診斷，結果為豬圓環病毒感染陽性。在貴州地區以PDNS為特征的臨床案例較為少見，現將相關診斷及發生情況給與報道，供廣大同業者參考，希望對豬場的疫病防控有所幫助。

1 發病情況調查

2018年7月，接貴州地區某縣動物疫病預防控制中心反映，該縣一黑毛豬養殖場飼養的豬經屠宰后發現身上長有許多腫大的淋巴結，多的甚至達到5 kg。初始認為是某寄生蟲病引起的皮膚病，但對病豬用驅蟲藥進行治療觀察10 d以上未見效果，其發病越顯嚴重，請求送檢實驗室以得到確診。

經現場實地檢查，該豬場存欄有190余頭雜交黑毛豬，豬群引進時就發現部分豬就有少許皮膚皰疹，在飼養過程中發現同舍的其他豬也逐步發病，皮膚皰疹發生面積逐步擴大，持續時間有10余個月，中間未發生過其他的疫（疾）病情況。

發病豬只均為育成肥豬，排查有臨床癥狀的患豬有30余頭，臨床發病率為15.79%。患豬精神狀況良好，飲食、糞便正常，全身皮膚均患有不同程度的局灶性皮炎，主要分布在頸部、前胛、下腹、四肢、臀部等皮膚上（如圖1、圖2、圖3所示部位）。用手觸摸患部皮下淺表處，有乒乓球到網球大小的硬性炎性結節，邊緣清晰，觸壓痛性不明顯。將病豬屠宰后檢查發現，肌肉與皮膚邊緣處見淋巴結腫大，呈大小不等的圓形包塊，病變組織切面呈邊緣規則的圓形或橢圓形壞死灶，內有大量的乳白色干酪樣炎性分泌沉積物（如圖4所示部位），其他臟器及組織未見異常。

2 PCR檢測

2.1 試驗材料及方法

2.1.1 試驗材料

檢測樣品為從發病豬場采集的豬淋巴結、肺病料組織；DL2000、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U Polymerase/μL）、TIANGEN血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；苯酚、氯仿、無水乙醇等均為國產試劑。

2.2.2 總DNA提取

分別取淋巴結、肺病組織樣品加入適量的PBS溶液研磨成漿，取上清，參照TIANGEN血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進行，提取的DNA于-20 ℃保存。

圖1 前后肢皮膚炎性結節

圖2 后肢體前側膚炎性結節

圖3 臀部皮膚炎性結節

圖4 皮下肌肉淋巴結壞死灶

2.2.3 引物設計

豬圓環病毒基因特異性引物：根據GenBank中登錄的PCV2全基因序列(KX898030) 高度保守區域，利用Primer 6.0 軟件設計特異性引物 A1/A2 (5′-TTCCATG GAGGTCTGTAG G-3′/5′-GAATGGATTGCCACTCG G-3′)， 預 期 擴 增 片 目 的 片 段 為353 bp。引物由上海寶生物公司合成。

豬偽結核棒狀桿菌基因特異性引物：參照?etinkaya等設計的偽結核棒狀桿菌16S rRNA引物(P1：5′-ACCGCACTTTAGTGTGTGT G-3′；5′ -P2：TCTCTAC GCCG ATCTTGTAT-3′)進行PCR擴增，預期擴增片目的片段為778 bp。引物由上海寶生物公司合成。

2.2.4 反應體系

豬圓環病毒反應體系為：以DNA為模板，PCR反應液16 μL，TaqDNA聚 合 酶 2 μL， 模 板DNA 2 μL。反應條件為：94 ℃ ，3 min ；94 ℃ ，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃， 45 s，共 35次；72 ℃延伸10 min。

豬偽結核棒狀桿菌反應體系為：以DNA為模板，PCR反應體系為25 μL：Taq DNA 聚合酶0.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物 P1、P2各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，無菌水 17 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃延伸 10 min。

3 檢測診斷結果

從圖5結果顯示，送檢樣品中均檢出圓環病毒特異性片段；從圖6結果顯示，待檢病理組織樣品均未檢出偽結核棒狀桿菌特異性片段。采集的發病豬病料組織樣品PCR病原核酸檢測結果為圓環病毒病原核酸檢測為感染陽性，目的片段 353 bp；偽結核棒狀桿菌病原核酸檢測為陰性。本次發生的疫病確診為豬圓環病毒感染。

4 結論與分析

在貴州地區，以黑毛豬為代表的地方品種豬群發生皮膚型為主的圓環病毒病感染在生產上實則較為少見。該病案呈現的豬皮下淺表淋巴結腫大、化膿性炎癥病變、發病情況以及其他臨床表征，均與豬偽結核棒狀桿菌感染極其相似，在臨床上難以區別，故PCR病原核酸檢測時與豬偽結核棒狀桿菌感染進行了鑒別診斷。因此，一旦豬群發生類似的疾病，建議應盡早送實驗室進行檢測診斷，不要耽誤疫病最佳的治療時間，為疫病的早期防控提供參考依據。

在畜禽養殖生產中，豬圓環病毒病感染為一種重要的豬免疫抑制性疫病，其高度的免疫抑制危害將對其他疫病的免疫防控帶來重要影響。因此，在對地方豬品種資源的收集、保護、開發與利用中，建議加大對豬圓環病毒病的檢測與凈化工作，避免該病在地方豬品種間的感染與傳播。

圖5 豬圓環病毒擴增圖

圖6 豬偽結核棒狀桿菌擴增圖