虹鱒魚油的超聲波輔助法提取及其脂肪酸組成分析

趙保堂，孫 棟，劉 東，劉倩霞，楊富民，張 繼

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，蘭州 730070； 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

虹鱒魚是世界名貴魚種之一，在我國廣泛養(yǎng)殖[1]。虹鱒魚肉質(zhì)細嫩，含脂量多，維生素D、鐵元素含量遠高于其他食品，而且油脂不飽和脂肪酸含量較高，食用后可降低人體血脂水平和軟化血管，可用于預(yù)防心臟病、高血壓等，并可促進大腦與視網(wǎng)膜發(fā)育[2]。因此，虹鱒魚油的的研究開發(fā)具有良好的市場前景。

超聲波是一種高頻率的機械振蕩波，通過產(chǎn)生空穴效應(yīng)強化萃取效果和萃取效率[3]。楊小克[4]研究了魷魚內(nèi)臟油脂的提取方法、脂肪酸組成及理化性質(zhì)，在提高魚油提取率的同時，明確提取方法對脂肪酸組成及理化性質(zhì)的影響。魏永生等[5]對虹鱒魚肌肉脂肪酸進行了GC-MS分析，其中不飽和脂肪酸含量較高，含有豐富的亞麻酸。孫麗霞等[6-7]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取羅非魚內(nèi)臟油脂工藝，并用不同方法提取了羅非魚內(nèi)臟油脂和對脂肪酸組成進行分析，結(jié)果表明超聲輔助提取法可縮短魚油提取時間，減少溶劑用量，提高魚油提取率。

目前，國內(nèi)外對魚油的提取分析有很多的文獻報道，但對于虹鱒魚油的超聲輔助提取研究鮮有報道。本文以虹鱒魚內(nèi)臟為原料，以石油醚為提取溶劑，比較分析超聲功率、超聲時間、超聲溫度、提取次數(shù)、液料比對魚油提取率的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，以魚油提取率為指標，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件，獲得超聲波輔助法提取虹鱒魚油的最佳工藝條件，并對虹鱒魚油的脂肪酸組成、過氧化值、酸價等進行分析，為后續(xù)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

虹鱒魚內(nèi)臟：購于蘭州市永登縣，去除膽囊及腸道內(nèi)消化物，洗凈瀝干，并用絞肉機絞碎成糜狀，冷藏備用。

無水乙醇、甲醇、異辛烷，均為色譜純；乙醚、石油醚(沸程60～90℃)、氫氧化鉀、鹽酸、硫酸氫鈉、硫酸鈉、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS 6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：江蘇天瑞儀器股份有限公司；SB-5200DTS超聲波清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；FA1104N電子分析天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虹鱒魚內(nèi)臟含油量測定

準確稱取虹鱒魚內(nèi)臟5.0 g，用濾紙包裹嚴實，置于索氏抽提器中，加入石油醚使包裹物完全浸沒在石油醚中，水浴加熱圓底燒瓶提取8 h，將提取后的液體用分液漏斗分離水分后，減壓蒸發(fā)揮去石油醚，稱量產(chǎn)物質(zhì)量，計算虹鱒魚內(nèi)臟的含油量。

1.2.2 虹鱒魚油的超聲波輔助提取

準確稱取虹鱒魚內(nèi)臟5.0 g置于50 mL錐形瓶中，根據(jù)實驗條件加入石油醚，設(shè)定好超聲儀器條件置于其中，超聲完畢后抽濾去除殘留物，將提取后的液體用分液漏斗分離水分后，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去石油醚，稱量魚油質(zhì)量，計算虹鱒魚油的提取率。以虹鱒魚油提取率為指標，考察超聲時間、液料比、超聲功率、提取次數(shù)、超聲溫度對虹鱒魚油提取率的影響，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

虹鱒魚油提取率=提取的魚油質(zhì)量/內(nèi)臟含魚油質(zhì)量×100%

1.2.3 酸價和過氧化值的測定

分別按照GB 5009.229—2016、GB 5009.227—2016測定虹鱒魚油的酸價、過氧化值。

1.2.4 脂肪酸組成的測定

脂肪酸甲酯的制備：參考張靜等[8]的方法制備脂肪酸甲酯。

GC條件：RTX-5MS 型彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫為柱溫160℃，保留2 min，然后以5℃/min 升至210℃，保持3 min，再以1℃/min 升至220℃，保持1 min，最后以5℃/min 升至250℃，保持1 min；進樣量2.5 μL。

MS條件：離子源為EI源，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲溫度對虹鱒魚油提取率的影響

在超聲時間30 min、液料比10∶1、超聲功率150 W、提取次數(shù)1次的條件下，考察超聲溫度(20、30、40、50、60℃)對虹鱒魚油提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲溫度對提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲溫度的升高，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，當超聲溫度為50℃時，提取率達到最大，之后提取率開始下降。這是因為在超聲溫度升高的過程中增加了溶劑分子和油脂分子的動能，使擴散運動能夠進行，進而魚油的提取率升高，此后升高超聲溫度對提取率無顯著作用[9]。因此，最佳超聲溫度確定為50℃。

2.1.2 超聲時間對虹鱒魚油提取率的影響

在超聲溫度50℃、液料比10∶1、超聲功率150 W、提取次數(shù)1次的條件下，考察超聲時間(10、20、30、40、50、60 min)對虹鱒魚油提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 超聲時間對提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，當超聲時間超過50 min時，提取率變化不大。這可能是因為隨著超聲時間的延長，在超聲波的空穴效應(yīng)下，虹鱒魚內(nèi)臟中越來越多結(jié)締組織被打斷，將更多魚油釋放出來；但虹鱒魚內(nèi)臟中的魚油是有限的，當釋放到一定程度后，隨超聲時間延長虹鱒魚油提取率增大不顯著[10]。因此，最佳超聲時間確定為50 min。

2.1.3 液料比對虹鱒魚油提取率的影響

在超聲時間50 min、超聲功率150 W、提取次數(shù)1次、超聲溫度50℃的條件下，考察液料比(4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1)對虹鱒魚油提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對提取率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增加，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，當液料比為10∶1時，提取率最大。液料比的大小決定了提取溶劑與虹鱒魚內(nèi)臟接觸程度的大小，液料比增大增加了虹鱒魚內(nèi)臟與溶劑間的濃度差，提高了油脂向溶劑擴散的速率，從而使提取率增大，當溶劑與魚油的比率達到飽和時，液料比將不再影響提取率[11]。因此，最佳液料比確定為10∶1。

2.1.4 超聲功率對虹鱒魚油提取率的影響

在超聲時間50 min、液料比10∶1、提取次數(shù)1次、超聲溫度50℃的條件下，考察超聲功率(100、125、150、175、200、225、250 W)對虹鱒魚油提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲功率對提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，當超聲功率為175 W時，提取率達到最大，之后提取率開始下降。這是由于超聲功率的強度對提取率有著決定性作用，超聲功率越大，空化作用與機械作用越激烈，界面擴散層上的分子擴散越快，但是超聲功率過大，超聲波的傳播衰減將增大，導(dǎo)致提取率增加緩慢甚至下降[12-13]。因此，最佳超聲功率確定為175 W。

2.1.5 提取次數(shù)對虹鱒魚油提取率的影響

在超聲時間50 min、液料比10∶1、超聲功率175 W、超聲溫度50℃條件下，考察提取次數(shù)(1、2、3、4次)對虹鱒魚油提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)對提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這主要是由于隨著提取次數(shù)的增加，石油醚與魚油的結(jié)合次數(shù)增加，使虹鱒魚內(nèi)臟中的魚油充分釋放，提取率逐漸變大，但過多的提取次數(shù)使后續(xù)處理步驟增加，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，且提取次數(shù)的增加對提取率的增加影響不顯著[14]。因此，在后續(xù)實驗中提取次數(shù)確定為1次。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

以單因素實驗為基礎(chǔ)，選取液料比(X1)、超聲時間(X2)、超聲溫度(X3)和超聲功率(X4)4個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，考察其對虹鱒魚油提取率的影響，以優(yōu)化虹鱒魚油提取工藝條件，響應(yīng)面實驗因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平

2.2.2 統(tǒng)計分析和模型擬合

采用Box-Behnken實驗設(shè)計，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到虹鱒魚油提取率(Y)對液料比(X1)、超聲時間(X2)、超聲溫度(X3)和超聲功率(X4)的二次多項回歸方程為：

運用Design-ExpertV8.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進行分析，得到虹鱒魚油提取率回歸方程的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

注：P<0.000 1，差異高度顯著，用**表示；P<0.05，差異顯著，用*表示。

2.2.3 驗證實驗

采用將回歸方程各自應(yīng)變量取一階偏導(dǎo)為零，得到的超聲波輔助法最佳提取條件為提取次數(shù)1次、超聲功率199.97 W、超聲時間57.8 min、超聲溫度54.62℃、液料比11.98∶1。為了實際操作的便利，取超聲波輔助法最佳工藝條件為提取次數(shù)1次、超聲功率200 W、超聲時間58 min、超聲溫度55℃、液料比12∶1。在此基礎(chǔ)上對優(yōu)化后的工藝條件進行驗證實驗，重復(fù)3次取平均值，虹鱒魚油提取率為95.10%。

所得虹鱒魚油為棕黃色，稍有渾濁沉淀，具有一般魚油的腥味，其酸價(KOH)為3.708 mg/g、過氧化值為1.516 mmol/kg,均符合SC/T 3502—2016粗魚油一級標準，可作為一種較好的食用油脂。

2.3 虹鱒魚油脂肪酸組成

超聲波輔助法提取的虹鱒魚油脂肪酸組成測定結(jié)果如表4所示。

表4 虹鱒魚油脂肪酸組成

由表4可知，超聲波輔助法提取所得虹鱒魚油主要有8種脂肪酸，包括12-甲基-十三烷酸、軟脂酸、亞油酸、亞麻酸、油酸、硬脂酸、EPA、DHA，其中亞油酸是主要的多不飽和脂肪酸，亞油酸含量為26.42%，亞麻酸含量為9.24%，EPA含量為1.12%，DHA含量為4.45%。單不飽和脂肪酸是油酸，含量為20.09%。因此，可以將虹鱒魚作為多不飽和脂肪酸的來源，其在營養(yǎng)保健和藥用領(lǐng)域?qū)辛己玫陌l(fā)展前景[15]。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助法提取虹鱒魚油，采用單因素實驗考察了超聲溫度、超聲功率、超聲時間、提取次數(shù)及液料比對虹鱒魚油提取率的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化虹鱒魚油超聲波輔助法提取工藝條件，得到最佳工藝條件為提取次數(shù)1次、超聲功率200 W、超聲時間為58 min、超聲溫度55℃、液料比12∶1，在此條件下虹鱒魚油提取率為95.10%。虹鱒魚油酸價和過氧化值符合粗魚油一級標準(SC/T 3502—2016)。虹鱒魚油中亞油酸、亞麻酸、EPA、DHA含量分別為26.42%、9.24%、1.12%和4.45%，油酸含量為20.09%。