蒜頭果中3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆與表達分析

李云琴，陳中華，原曉龍，王 毅

(云南省林業科學院云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室, 國家林業局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，昆明 650201)

神經酸(Nervonic acid，NA)具有促進大腦發育、改善記憶、調節血脂等功效，對心血管疾病及免疫性疾病的治療效果顯著[1-3]，是大腦中神經細胞及神經纖維的核心天然成分，神經酸還可以作為香料原料加以利用[4]。雖然神經酸用途廣泛，對人體健康有益，但難以通過人體自身合成，需要從外界攝取。神經酸最早在鯊魚油中獲取[5]，但鯊魚資源稀少且成本高昂，加之國際社會禁止大量捕殺鯊魚，神經酸的來源受到限制，造成資源緊缺，市場供不應求。通過化學方法[6]和生物化學[2]合成神經酸，終因副產物多、工藝路線長、得率低而失敗。后來，研究發現一些植物中富含神經酸，如蒜頭果(Malaniaoleifera)及盾葉木(Macarangaadenantha)種仁，雞爪槭(Acerpalmatum)果實及遏藍菜(Thlaspiarvense)種子[7]、元寶楓(Acertruncatum)種子[8]等。而我國特有的鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬單種屬植物蒜頭果，為目前發現的自然界中神經酸含量最高的植物[9]。研究顯示，蒜頭果種仁含油率高達64.5%[10]，其果仁油脂中神經酸含量高達60%以上。因此，從蒜頭果果仁中提取神經酸將為可持續開發利用植物神經酸開創一條新路[11]。

神經酸為超長鏈單不飽和脂肪酸(VLCMFA)[12]。VLCMFA以油酸為底物，通過超長鏈脂肪酸鏈延長循環進行碳鏈的延長，每循環1次延長2個碳原子，相繼形成鱈油酸(20∶1Δ9c)、芥酸(22∶1Δ13c)、神經酸(24∶1Δ15c)[3]。這個延長過程受3-酮酯酰-CoA合酶、3-酮酯酰-CoA還原酶、3-羥酯酰-CoA脫水酶和羥酯酰-CoA還原酶形成的酶復合體的組合催化和調控，其中3-酮酯酰-CoA 合酶(KCS)目前被認為是關鍵催化步驟[13-15]，在整個超長鏈脂肪酸延長酶復合體中起到了極其重要的作用，因此也作為限速酶被廣泛應用[16-18]。目前對KCS的研究主要在油菜(Brassicanapus)[18]、大豆(Glycinemax)[19-20]、油桐(Verniciafordii)[21]、滇牡丹(Paeoniadelavayi)[22]等傳統油料植物中，而對蒜頭果的KCS相關研究未見報道，特別是超長鏈KCS在蒜頭果中神經酸生物合成的作用并不清楚。因此，本研究利用轉錄組測序技術獲得蒜頭果果實中超長鏈KCS基因序列，同時，利用RT-PCR克隆獲得該基因，并進行生物信息學分析及表達分析，為最終揭示蒜頭果神經酸生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需蒜頭果樹生長于文山州廣南縣舊莫鄉巖臘村，采集花謝后1、2、3、4個月的蒜頭果果實為材料，并采集花謝2個月后蒜頭果樹葉作為對照。樣品采集后即刻放入液氮中保存。

總RNA小量提取試劑盒購自美國Qiagen公司，pESY-T3克隆試劑盒與感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司，LA-Taq酶、反轉錄酶M-MLV購自大連寶生物工程有限公司。電泳儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉錄組分析

將花謝后3個月的蒜頭果果實送到華大基因通過Illumina Hiseq2000平臺進行轉錄組測序，對序列進行組裝拼接后，通過對轉錄組Unigene進行本地Blast,尋找蒜頭果果實轉錄組中的KCS基因，同時，將轉錄組數據中的Unigene注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數據庫，檢索注釋結果中的KCS基因，并對獲得的Unigene進行分析。

1.2.2 提取RNA

提取蒜頭果果實RNA，按照RNA提取試劑盒說明書進行提取。分別提取每個樣品的RNA后，用1%的瓊脂膠進行電泳檢測RNA完整性。并分別取1 μg RNA用于反轉錄得到cDNA。將各樣品cDNA保存在-20℃冰箱備用。

1.2.3 蒜頭果KCS基因克隆

通過對蒜頭果轉錄組數據分析，獲得表達量高、并擁有完整開放閱讀框的KCS基因序列。以獲得的KCS基因序列,設計含有起始密碼子的特異引物(MoKCSF:5′-ATGGCTCAACCAAAGCTTGT-3′)和含有終止密碼子的特異引物(MoKCSR:5′-TTAGATGGCCGAGACTTGCG-3′)。以蒜頭果果實cDNA 為模板，用HiFi高保真聚合酶進行PCR擴增，電泳檢測后將目的片段連接到pGMT載體上，并轉入DH5α感受態細胞中，通過菌落PCR篩選出陽性克隆，送上海生工測序公司進行測序，最終通過序列比對確定獲得KCS全長基因片段，并永久保存在-80℃冰箱。

1.2.4 蒜頭果KCS蛋白生物信息學分析

用NCBI在線軟件ORFFinder對KCS基因進行蛋白翻譯后，并用在線軟件ProtParam對KCS蛋白理化性質進行分析，KCS保守結構域分析由在線蛋白功能結構域分析軟件完成，其氨基酸同源序列比對則用DNAMAN 軟件完成，最終確定KCS的保守結構域。并將蒜頭果KCS蛋白與美國國家生物技術信息中心(NCBI)已知其他植物的超長鏈KCS蛋白進行多重比對后，采用MEGA7中自帶的ClusterW進行蛋白序列多重比對后，采用Neighbor-joining算法(自檢舉1 000 次)，繪制并進行進化樹分析。

1.2.5 蒜頭果KCS基因不同組織表達分析

分別取蒜頭果不同組織的RNA 2 μg，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。以不同組織的cDNA為模板，用特異引物TMoKCSF(5′-ATCTTTGGTGTTCTTGATCG-3′)和TMoKCSR(5′-ATTGAATAAG CTACAATTGA-3′)進行熒光定量PCR分析，并以elongation factor 1-alpha基因作為內參基因，具體反應體系如下：分別向PCR管中加入2×SYBR Green master mix(含ROX) 12.5 μL； 引物TMo-KCSF和TMoKCSR各0.5 μL，cDNA 1 μL,最終用 PCR water nucle-free補足25 μL。PCR反應條件為：預變性溫度95℃，時間10 min，然后，變性溫度95℃，時間15 s；退火和延伸溫度為 60℃，時間為30 s，共40個循環。反應結束后，收集信息進行Ct值分析。

2 結果與分析

2.1 轉錄組分析

通過Illumina Hiseq2000平臺測序對蒜頭果果實轉錄組測序，總計產出6 299 384 146 bp數據。組裝結果得到165 110個Unigene。對所獲得的Unigene進行本地Blast以及在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數據庫比對分析， 最終獲得13個可能的KCS基因片段(見表1)。

表1 轉錄組分析得到的KCS基因信息

由表1可知，根據已知其他植物KCS基因大小在1 kb以上,從轉錄組數據中最終得到大于1 kb的KCS基因片段有2個。通過蛋白序列分析以及表達量分析最后確定c55526_g1作為后續克隆分析的對象。

2.2 RNA提取與基因克隆

將蒜頭果不同時期的果實和葉片樣品，經過液氮磨碎后，用RNA提取試劑盒提取各樣品RNA，并進行電泳檢測查看其完整性，電泳結果見圖1。

注：F1、F2、F3、F4分別為花謝1、2、3、4個月后蒜頭果果實; Leaf為花謝2個月后蒜頭果樹葉。

圖1 提取的RNA電泳結果

由圖1可看出，所有樣品均有完整的28S和18S兩個條帶，說明RNA完整性比較好。條帶明亮度不一樣說明提取的各個樣品RNA濃度不一樣。用分光光度計測量各樣品RNA在260、280 nm下的吸光度。檢測顯示各樣品OD260/OD280值均在1.8～2.1之間，適合于后續反轉錄實驗。

基于轉錄組數據中獲得的KCS基因片段序列的特異引物(MoKCSF和MoKCSR)，以MoKCSF和MoKCSR為引物，以蒜頭果花謝2個月后的果實cDNA為模板，進行高保真PCR擴增，將擴增出來的目的片段連接到克隆載體中，并進行測序比對驗證。最終獲得 1 539 bp的蒜頭果KCS基因全長cDNA，并命名為MoKCS1。

2.3 蒜頭果KCS蛋白序列分析

用NCBI在線軟件ORFFinder對KCS基因進行蛋白翻譯后，并用在線軟件ProtParam對KCS蛋白理化性質進行分析，結果顯示KCS基因共編碼512個氨基酸，其相對分子質量為57 730.49，等電點為9.39。利用NCBI在線結構域分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)以及DNAMAN軟件對與KCS親緣關系近的其他植物KCS蛋白序列進行比對，見圖2。由圖2可以看出，該蛋白與已報道的KCS含有KCS家族的3個功能保守結構域“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和“GMGCSA”，表明該蛋白屬于KCS 家族蛋白。蒜頭果KCS與榴蓮(Duriozibethinus)KCS的蛋白序列同源性為80.66%，與芝麻(Sesamumindicum)KCS同源性為79.49%，與山黃麻(Tremaorientalis) KCS同源性為78.72%。

2.4 系統進化樹分析

將推導出來的KCS蛋白序列在美國國家生物技術信息中心(NCBI)進行比對，用MEGA7中自帶的ClusterW進行蛋白序列多重比對后，采用Neighbor-joining算法(自檢舉1 000 次)，繪制出蒜頭果KCS與其他植物的KCS蛋白的進化樹，見圖3。從圖3可以看出，蒜頭果的KCS蛋白在系統進化樹上自成一支，與目前發現的KCS蛋白的親緣關系都相對較遠。

2.5 熒光定量PCR檢測KCS基因不同組織表達

為了解KCS基因在蒜頭果不同個體之間的表達差異，以特異引物TMoKCSF和TMoKCSR，用熒光定量PCR檢測KCS基因在不同樣品中的表達情況，結果見圖4。由圖4可以看出，KCS基因在不同個體中以花謝3個月后蒜頭果果實表達量最高，花謝2個月后蒜頭果果實次之，而在花謝1個月及4個月后的蒜頭果果實和蒜頭果葉中表達都非常微弱。

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注：MoKCS.蒜頭果KCS(登錄號：MK210592);DzKCS.榴蓮KCS(登錄號：XP_022729498.1)；SiKCS.芝麻KCS(登錄號：XP_011081914.1)；ToKCS.山黃麻KCS(登錄號：PON90748.1)。

圖2 KCS蛋白序列比對

圖3 蒜頭果KCS與其他植物KCS蛋白系統進化樹

注：MoF1、MoF2、MoF3、MoF4分別為花謝1、2、3、4個月后蒜頭果果實KCS基因;MoLe為花謝2個月后蒜頭果樹葉KCS基因。

圖4 蒜頭果KCS基因表達情況

3 討 論

神經酸(C24∶1)具有獨特的工業用途和潛在的藥用保健功效，近年來得到了國內外的廣泛關注。特別是從植物中獲取神經酸受到許多研究者的青睞。雖然很多植物含有神經酸，但是大多含量很低，蒜頭果是目前神經酸含量最高的植物，因此可以在揭示蒜頭果中神經酸生物合成機理的情況下，利用分子輔助育種等方式培育出高產神經酸的蒜頭果新品種，或利用基因工程通過異源表達的方式利用酵母[23-24]大量獲得神經酸。因此，本研究開展蒜頭果中神經酸生物合成關鍵酶KCS基因的克隆及表達分析。

目前已有一些關于KCS基因通過異源表達提高神經酸含量的研究，如Guo等[18]報道通過引入銀扇草的KCS基因來增加酵母和轉基因植物中神經酸含量；Taylor等[25]報道了在碎米薺屬油籽中，一種KCS基因的分子克隆和特性，以及其在碎米薺屬油籽中的異源表達，為潛在的醫療和工業用途提供高神經酸油。針對MoKCS基因，未來的研究可以將MoKCS基因導入目前油脂高產的植物中，通過MoKCS及超長鏈脂肪酸生物合成復合體合成神經酸；同時，也可以將MoKCS導入目前已經開發出來的高產油脂酵母中，通過酵母發酵的方式獲得神經酸。最終為神經酸產業發展奠定堅實的基礎。

4 結 論

本研究利用轉錄組測序技術首先獲得蒜頭果果實中KCS基因序列，并利用RT-PCR技術克隆獲得全長開放閱讀框MoKCS1，其全長1 539 bp，編碼含512個氨基酸，生物信息學分析結果顯示，MoKCS1含有KCS蛋白家族的保守結構域“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和“GMGCSA”，與已報道的KCS具有高度一致性，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。蒜頭果KCS與榴蓮(Duriozibethinus)KCS的蛋白序列同源性最高，為80.66%，與芝麻(Sesamumindicum)和山黃麻(Tremaorientalis)KCS同源性分別為79.49%、78.72%。通過與NCBI中已知KCS構建分子進化樹分析，顯示MoKCS1非常特殊，自成一支，說明MoKCS1非常特殊。熒光定量PCR顯示MoKCS1在不同個體中以花謝3個月的蒜頭果果實表達量最高，而花謝3個月正是蒜頭果果實膨大期，神經酸的累積期。這說明MoKCS1與蒜頭果神經酸生物合成密切相關。