川明參醇提取物抗氧化性及熱穩定性研究

萬 重，肖丹桃，王淑君，王越梅，張 清

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014)

川明參(ChuanminshenViolaceumSheh et Shan)屬傘形科、川明參屬根下植物，因極易與其他品種相混而未在歷代本草中收載，從現今對川明參的報道來看，其開發利用的程度較低。有研究應用乙醇提取川明參根粉中的成分，鑒定出7種化合物，包括香豆素傘形花內酯、阿魏酸、胡蘿卜苷、印度枸橘素等[1]。董紅敏等[2]應用超聲輔助提取川明參中的揮發油，并檢測出76種成分，鑒定并確定其中42種化合物，含量較多的為鐮葉芹醇、亞油酸和歐前胡素等。此外，還應用95%乙醇超聲輔助提取其中的抗氧化活性成分，發現成分中蛋白質和多糖含量較多，且具有較強的抗氧化能力[3]。香豆素是川明參的重要成分，有研究顯示超聲輔助醇提法可以提高香豆素的提取率[4]。川明參還包括黃酮、甾醇、有機酸、酚類、鞣質和萜類等化學成分[5-6]。川明參干燥根中至少含有13種氨基酸，其中含量較高的有天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸[7]。有研究認為把川明參粉加入到豬油中可以減緩油脂的氧化，提示川明參可以進行開發利用，有潛力作為食品抗氧化劑應用于食品加工領域[8]。

油脂在加熱或煎炸過程中會發生氧化、水解及聚合等一系列化學反應，不僅破壞其原有的不飽和脂肪酸及維生素等營養成分，而且還產生醛、酮等有害物質。一般來說，添加抗氧化劑及經過一些物理方式的處理可以延長油脂的使用壽命。抗氧化劑根據其來源可分為天然抗氧化劑與合成抗氧化劑。天然抗氧化劑主要為植物中提取出來的活性物質，包括生育酚、鼠尾草酚、類黃酮和芝麻酚等；合成抗氧化劑通常使用的為丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)和叔丁基對苯二酚(TBHQ)等[9]。雖然天然抗氧化劑具有高效和低毒等優勢，但大多數的天然抗氧化劑的熱穩定性較差，容易在加熱反應中揮發出去。合成抗氧化劑均能表現出較好的抗氧化性，但對人體健康的潛在威脅使其有限量要求[10]。因此，需從天然材料中尋找有效的抗氧化劑并能應用于油脂的抗氧化。本實驗以川明參為原料，采用超聲輔助乙醇提取技術提取川明參粉中的抗氧化活性物質，并將川明參醇提取物添加到大豆油中，探究其對油脂加熱氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

無添加抗氧化劑的大豆油，購于九三集團營銷有限公司；川明參采自四川省金堂縣，采摘時間為2018年3月下旬，新鮮川明參采摘后立即帶回實驗室，洗凈放入-20℃冰箱，取出晾干后，用粉碎機粉碎成100～200目粉末。

乙醚、無水乙醇、2,4-二硝基苯肼、苯、三氯乙酸、甲苯、甲醇鈉、氫氧化鉀、三氯化鐵、抗壞血酸(VC)和TBHQ均為分析純，正己烷、甲醇為色譜純，購于雅安萬科試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和37種脂肪酸混合標準品(CRM47885)，購于Sigma試劑公司。

1.1.2 儀器與設備

艾拓金牌節能型電炸爐，BS 214D電子天平，UV-6100紫外分光光度計，7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，電子溫度計(德國易克賽思國際有限公司)，DK-9811恒溫水浴鍋，AUW22D十萬分之一天平(日本島津儀器公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 川明參醇提取物的提取

川明參醇提取物的提取參照董紅敏[11]的醇提取方法，略有改進。準確稱取50 g川明參干燥粉，加入500 mL 80%乙醇溶液，在49℃下超聲(225 W)輔助提取38 min。過濾提取液在45℃下真空旋轉蒸發呈濃縮物，再經100 mL無水乙醇分3次洗滌，濾去不溶解的多糖成分。濾液在45℃下真空旋轉蒸發，直到乙醇蒸發干，得到川明參醇提取物，將其收集后保存在4℃條件下，備用。

1.2.2 DPPH自由基清除率的測定

以無水乙醇為溶劑，分別配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液，質量濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL的川明參醇提取物溶液和質量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL VC溶液。精確吸取4 mL不同質量濃度的川明參醇提取物溶液和VC溶液，加入4 mL DPPH溶液，搖勻后在暗室下放置30 min，以無水乙醇為對照，在517 nm波長處測定上述溶液的吸光度[12]。按照下式計算DPPH自由基清除率。

式中：A為樣品與DPPH混合溶液的吸光度；A0為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與DPPH混合溶液的吸光度。

1.2.3 ABTS+自由基清除率的測定

將ABTS及過硫酸鉀用少量水溶解，再用無水乙醇配制濃度為7×10-3mol/L的ABTS溶液和濃度為2.5×10-3mol/L的過硫酸鉀溶液，并將二者等體積混合，在暗處放置12 h后待用。配制質量濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL的川明參醇提取物溶液和質量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL VC溶液。精確吸取1 mL不同質量濃度川明參醇提取物溶液和VC溶液，加入5 mL ABTS和過硫酸鉀的混合溶液，搖勻后在室溫條件下避光反應30 min，以無水乙醇為對照，在734 nm波長處測定上述溶液的吸光度[13]。按照下式計算ABTS+自由基清除率。

式中：A為樣品與ABTS和過硫酸鉀混合溶液的吸光度；A0為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與ABTS和過硫酸鉀混合溶液的吸光度。

1.2.4 川明參醇提取物對鐵還原能力的測定

用無水乙醇配制質量濃度分別為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL的川明參醇提取物溶液和質量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的VC溶液，分別取1 mL上述溶液于試管中，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1 g/100 mL鐵氰化鉀2.5 mL，混勻并在50℃水浴保溫20 min，再加入10 g/100 mL三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL于試管中，再加入去離子水2.5 mL和0.1 g/100 mL三氯化鐵0.5 mL，常溫反應5 min后在700 nm波長處測定吸光度[14]。

1.2.5 加熱氧化實驗

將0%、0.05%、0.1%、0.3%和0.5%的川明參醇提取物及0.02%的TBHQ分別添加到500 mL大豆油中，在室溫下混勻并室溫放置24 h。將上述各大豆油樣品分別裝入試管中，進行180℃油浴加熱實驗。分別在0、3、6、9、12、15、18 h和21 h取樣，待冷卻后，放入-4℃冰箱中待測。

1.2.6 酸價、羰基價與脂肪酸組成的測定

酸價的測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》，羰基價的測定參照GB 5009.230—2016《食品安全國家標準 食品中羰基價的測定》。

油樣甲酯化采用堿化催化法[15]。稱取油樣25～30 mg于20 mL具塞試管中，加入1 mL無水甲苯，再加入1 mL濃度為0.5 mol/L的甲醇鈉-甲醇溶液，50℃恒溫處理10 min。冷卻后依次添加0.1 mL冰醋酸和1 mL去離子水，搖勻，然后用5 mL正己烷洗滌，取上層清液有機相1 mL用正己烷稀釋5倍，最后用無水硫酸鈉脫水、0.22 μm的有機濾膜過濾，放入-4℃冰箱保存待測。采用氣相色譜-質譜聯用法進行脂肪酸組成分析。

氣相色譜條件：HP-88毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.2 μm)；不分流進樣，進樣量1 μL；進樣口溫度250℃；氦氣流速1 mL/min；柱溫箱初始溫度120℃保持1 min，以5℃/min升到175℃保持10 min，以5℃/min升到190℃保持5 min，以5℃/min升到200℃保持5 min。

質譜條件：離子源和四極桿溫度分別為230℃和150℃；質譜掃描范圍(m/z)為40～400；采用全掃描模式。

1.2.7 數據分析

所有數據進行3次重復實驗，應用SPSS 22.0進行數據統計與分析，顯著性差異采用Duncan以及ANOVA檢驗，應用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 川明參醇提取物對DPPH自由基的清除能力(見圖1)

由圖1A可知，在質量濃度(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL)范圍內，川明參醇提取物對DPPH 自由基具有明顯的清除能力，且清除能力隨其質量濃度的增加而增強。川明參醇提取物在質量濃度為5～25 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率為39.39%～95.52%。由圖1B可知，VC質量濃度為0.02～0.05 mg/mL時，其對DPPH自由基清除能力變化不顯著。將川明參醇提取物對DPPH自由基清除能力與VC進行比較，發現質量濃度為25 mg/mL 的川明參醇提取物對DPPH自由基的清除能力高于質量濃度為0.04 mg/mL的VC。可推斷川明參醇提取物中含有抗氧化活性物質，對DPPH自由基具有顯著的清除能力，且在質量濃度為5～20 mg/mL時，其對DPPH自由基清除能力增加趨勢較快，質量濃度為20～25 mg/mL時的增加趨勢變緩。

圖1 川明參醇提取物、VC對DPPH自由基的清除能力

2.2 川明參醇提取物對ABTS+自由基的清除能力(見圖2)

圖2 川明參醇提取物、VC對ABTS+自由基的清除能力

由圖2A可以看出，在質量濃度(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL)范圍內，川明參醇提取物對ABTS+自由基具有明顯的清除能力，其清除能力隨質量濃度的增加而增強。當川明參醇提取物質量濃度為25 mg/mL時，對ABTS+自由基的清除能力為74.41%。由圖2B可知，VC質量濃度為0.02～0.05 mg/mL時，對ABTS+自由基的清除能力均大于89%，且增加趨勢不明顯。將VC與川明參醇提取物對ABTS+自由基的清除能力相比，川明參醇提取物對ABTS+自由基的清除能力相對較弱。但隨著川明參醇提取物質量濃度的增加，其對ABTS+自由基的清除能力也會逐漸升高。可推斷川明參醇提取物對ABTS+自由基的清除能力與其質量濃度相關，質量濃度越大，對ABTS+自由基的清除能力越強。

2.3 川明參醇提取物的鐵還原能力(見圖3)

圖3 川明參醇提取物、VC的鐵還原能力

由圖3可以看出，川明參醇提取物和VC在一定的質量濃度范圍內都具有較強的鐵還原能力，且隨著質量濃度的增加，鐵還原能力增強。VC質量濃度為0.01～0.05 mg/mL時，吸光度為0.10～0.30，川明參醇提取物質量濃度為5～25 mg/mL時，吸光度為0.14～0.26。川明參醇提取物對鐵離子的還原能力隨著質量濃度的增加趨勢相比VC緩慢。

2.4 川明參醇提取物的熱抗氧化能力

通過添加不同量的川明參醇提取物(CE)在大豆油中，以添加0.02%TBHQ和無添加抗氧化劑的大豆油(Blank)為對照，分析不同加熱時間每種油樣的酸價、羰基價，結果如圖4～圖5所示。

圖4 不同條件下大豆油在加熱過程中酸價的變化

由圖4可知，隨著加熱時間的延長，每種大豆油的酸價逐漸增大，但增加的趨勢有明顯差異。其中無添加抗氧化劑的大豆油酸價的增加趨勢最快，在21 h內酸價(KOH)的變化范圍為0.24～0.37 mg/g；添加0.02%TBHQ的大豆油酸價增加趨勢最緩慢，在21 h內酸價(KOH)的變化范圍為0.24～0.33 mg/g。在21 h時添加川明參醇提取物的大豆油中，添加0.3%川明參醇提取物的大豆油酸價(KOH)最低，為0.34 mg/g。TBHQ和川明參醇提取物在大豆油加熱過程中，對抑制大豆油酸價的增加都有明顯的效果，然而在不同添加量的川明參醇提取物作用下，大豆油酸價表現出不同的增加趨勢。

由圖5可知，隨著加熱時間的延長，每種大豆油的羰基價逐漸增大，但增加的趨勢有顯著差異。其中無添加抗氧化劑的大豆油羰基價增長趨勢最快，在21 h的羰基價達到52.78 meq/kg；同時間下添加0.02%TBHQ的大豆油羰基價為46.48 meq/kg，添加0.1%、0.3%和0.5%的川明參醇提取物的大豆油羰基價均小于TBHQ的。可見，添加川明參醇提取物對大豆油羰基價的增加具有明顯的延緩效果。

圖5 不同條件下大豆油在加熱過程中羰基價的變化

在180℃條件下加熱21 h，無添加抗氧化劑、添加0.02% TBHQ和不同添加量的川明參醇提取物的大豆油脂肪酸組成變化情況如表1所示。

表1 不同條件下大豆油在加熱過程中主要脂肪酸組成的變化情況

續表1

脂肪酸加熱時間/h含量/%Blank0.02%TBHQ0.05%CE0.1%CE0.3%CE0.5%CEC18∶3005.43±0.01d05.44±0.02d05.42±0.03e05.44±0.04h05.44±0.04d05.45±0.04de305.13±0.04cd05.45±0.11d05.34±0.03de05.38±0.01g05.39±0.07d05.51±0.01e604.92±0.07cd05.26±0.01c05.25±0.06d05.21±0.03f05.35±0.01cd05.45±0.04de904.75±0.31bc05.17±0.05c05.11±0.07c05.15±0.05e05.31±0.01bc05.32±0.07cd1204.59±0.35ab05.04±0.02b04.94±0.04b04.94±0.02c05.24±0.02ab05.29±0.07bc1504.62±0.28bc04.99±0.01b04.95±0.05b04.97±0.06d05.16±0.05a05.20±0.07bc1804.39±0.25ab04.93±0.07ab04.79±0.01a04.80±0.05b05.03±0.07ab05.18±0.07b2104.15±0.02a04.86±0.01a04.31±0.01a04.72±0.06a04.76±0.07a04.85±0.05a 注:同列不同小寫字母表示差異顯著,顯著水平α=0.05。

由表1可知，大豆油中不飽和脂肪酸(除C18∶1)含量隨加熱時間的延長而減少，飽和脂肪酸含量增加。C16∶0增加量最小的為添加0.1%川明參醇提取物的大豆油(增加量0.81個百分點)，其次為添加0.3%川明參醇提取物的大豆油(增加量0.82個百分點)。C18∶2和C18∶3在加熱過程中，隨加熱時間的延長而逐漸降低。添加0.02%TBHQ的大豆油C18∶2減少量最小，為1.31個百分點，減少量最大的為添加0.05%川明參醇提取物的大豆油，為2.38個百分點。對大豆油C18∶2的減少量延緩效果順序為0.02%TBHQ>0.5%川明參醇提取物>0.1%川明參醇提取物>0.3%川明參醇提取物> 無添加>0.05%川明參醇提取物。C18∶3減少量最小的為添加0.02%TBHQ的大豆油，為0.57個百分點，其次為添加0.5%川明參醇提取物的大豆油，為0.61個百分點。對大豆油C18∶3的減少量延緩效果順序為0.02%TBHQ>0.5%川明參醇提取物>0.3%川明參醇提取物>0.1%川明參醇提取物>0.05%川明參醇提取物>無添加。

由此可見，在大豆油加熱過程中，添加川明參醇提取物，對大豆油飽和脂肪酸的增加及多不飽和脂肪酸的減少，均有一定的抑制作用，且不同添加量的川明參醇提取物對各種脂肪酸的組成變化有明顯差異。

3 結 論

本實驗采用體外抗氧化能力測試和大豆油加熱氧化測試，對川明參醇提取物的抗氧化能力進行評價。由抗氧化指標分析顯示，川明參醇提取物中含有抗氧化活性物質，對DPPH、ABTS+自由基清除能力和鐵還原能力都具有明顯效果，且隨質量濃度的增加，其抗氧化能力逐漸增強。川明參醇提取物對大豆油的熱氧化具有明顯的抑制效果，其抑制酸價增加效果最好的是0.3%川明參醇提取物；抑制羰基價增加效果最好的是0.5%川明參醇提取物。對于C16∶0、C18∶0的增加量，不同添加量的川明參醇提取物均表現出明顯的抑制效果。對于C18∶2和C18∶3的減少量，添加0.5%的川明參醇提取物對延緩其減少的效果略低于TBHQ。因此，川明參醇提取物在油脂高溫加熱過程中可以有效延緩油脂的氧化速率，有潛力應用于食用油的貯藏或高溫加熱，從而延長油脂的使用壽命。