可切換親水溶劑高效提取藻油及巖藻黃素含量分析

孫維維，林 欣，史博文，溫運啟，李兆杰，姜曉明，黃文燦，薛長湖

(中國海洋大學 食品學院，山東 青島 266003)

巖藻黃素是一種主要的海洋類胡蘿卜素，在一些大型和微型藻類中大量存在，占自然界類胡蘿卜素估計總產量的10%以上。在微藻中尋找天然巖藻黃素來源時發現，三角褐指藻含有的巖藻黃素為主要類胡蘿卜素[1]。巖藻黃素及其代謝產物已被證明具有多種益處[2]，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗肥胖效果[3-4]。Maeda等[5]證明，在小鼠和大鼠的飲食中添加巖藻黃素導致其腹部白色脂肪組織減少。因此，巖藻黃素值得進一步研究。

目前從微藻中提藻油的方法主要使用有機溶劑提取，經過旋轉蒸發得到藻油[6-7]，如果要投入工廠化生產，旋轉蒸發耗能巨大。本文采用可切換溶劑，用CO2和水，節能高效地提取藻油。可切換溶劑是可以轉換親水親油特性的一種特殊液體，在通入或者去除CO2的情況下可逆地從一種形式切換到另一種形式[8]，包括可轉換親水性溶劑(SHS)和可轉換極性溶劑(SPS)[9]，其不揮發且不易燃，從而避免溶劑回收過程中的揮發或蒸餾。作為提取溶劑，SHS比SPS以及常規提取溶劑更具吸引力，因為SHS更適合提取含水量較多的物料。如果SPS提取含水量較高的物料則會形成一種碳酸氫鹽[10]。除此之外，SHS價格更低，更穩定。SHS與水的混溶性是完全可逆的，因為在輕輕地除去(即用低熱量，用惰性氣體鼓泡)之后，SHS會返回到原來的疏水狀態。Huang等[11]提出用可切換溶劑N，N-二甲基環己胺(DMCHA)從雨生紅球藻中提取蝦青素。

本文探討可切換親水溶劑DMCHA提取三角褐指藻藻油的可行性，探究三角褐指藻干粉以及80%水分含量的三角褐指藻藻泥的藻油得率隨著時間以及料液比的變化，用掃描電鏡觀察三角褐指藻干粉提油前后的表面結構變化，并分析比較了氯仿甲醇法、乙醇法、DMCHA法提取的藻油巖藻黃素含量，最后通過分析藻油中溶劑殘留判斷分離效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三角褐指藻藻泥，青島能源所提供。藻泥儲存在-20℃，藻泥凍干后得到的干粉儲存在干燥器皿內。

乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲基叔丁基醚(色譜純)，美國Muskegon公司；鹽酸、N,N-二甲基環己胺(DMCHA)、對苯二甲酸二甲酯、二氯甲烷、氯仿、無水乙醇、D-14己烷，均為分析純。

磁力攪拌器；循環水式真空泵；TGL-20K離心機；1100型HPLC儀(配有二極管陣列檢測器),美國Agilent公司；Lab-1A-50E冷凍干燥機；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡，日本Hitachi；MMV-1000W型振搖器；核磁日本精密電子天平；RE52CS型旋轉蒸發儀；布魯克600 MHz核磁共振譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 三角褐指藻藻油提取

分別稱量三角褐指藻藻泥和干粉1 g加入一定量的DMCHA。將微藻-DMCHA混合物在室溫下磁力攪拌一段時間。然后，以7 000 r/min離心5 min。上清液加入相當于DMCHA兩倍體積的H2O，并使用氣體分散管對混合物進行CO2鼓泡15 min。在藻油層漂浮到溶液頂部之后，收集藻油入玻璃瓶中，放入-20℃的冰箱中儲存。

1.2.2 巖藻黃素含量測定

1.2.2.1 提取

氯仿甲醇法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL 氯仿甲醇(體積比2∶1)混合溶劑，室溫磁力攪拌器提取1 h后抽濾，濾液加入與甲醇等體積的水，靜置分層后取氯仿層旋蒸得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的濾膜過濾于液相小瓶中待檢測。

乙醇法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL無水乙醇，室溫磁力攪拌器提取3 h后抽濾，濾液旋蒸得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的濾膜過濾于液相小瓶中待檢測。

DMCHA法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL DMCHA，室溫磁力攪拌器提取3 h后加水通CO2后得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的濾膜過濾于液相小瓶中待檢測。

1.2.2.2 液相色譜分析

使用裝備有紫外檢測器(日本京都島津的SPD-20A)和Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)的HPLC測定巖藻黃素含量。流動相為80%的乙腈(A)和20%甲基叔丁基醚(B)；流速0.8 mL/min；洗脫程序為0～8 min 100%A，8～16 min 90%A，16～22 min 100%A；柱溫25℃；進樣量30 μL；檢測波長450 nm。

1.2.3 藻粉提油前后表面結構變化

使用掃描電子顯微鏡在20 kV的加速電壓下表征三角褐指藻干粉提油前后的形態[12]。

1.2.4 藻油中DMCHA殘留量分析

2 結果與討論

2.1 三角褐指藻干粉的藻油得率

選擇三角褐指藻干粉為原料，在室溫下，測定三角褐指藻干粉在不同料液比、不同提取時間條件下的藻油得率。結果見圖1。

由圖1可知，隨著料液比由1∶5增加到1∶25，藻油得率不斷上升，增長趨勢逐漸降低，到1∶15之后藻油得率緩慢增長，到1∶20之后幾乎無增長。根據傳質平衡的原理，在一定范圍內，提取溶劑越多，溶解于其中的油越多，得率越高[14]。隨著提取時間延長，藻油得率也逐漸增加，到12 h以后趨于穩定。隨著提取時間的延長，藻粉與提取溶劑中的油濃度差不斷縮小，一定時間后，二者中的油濃度基本相同，此時擴散基本達到平衡[15]。最終干粉藻油得率在料液比1∶25、提取時間24 h條件下達到21.29%。

圖1 三角褐指藻干粉藻油得率隨料液比、提取時間的變化

2.2 三角褐指藻藻泥的藻油得率

選擇三角褐指藻藻泥為原料，在室溫下，測定三角褐指藻藻泥在不同料液比、不同提取時間條件下的藻油得率。結果見圖2。

圖2 三角褐指藻藻泥藻油得率隨料液比、

由圖2可知，三角褐指藻藻泥的藻油得率明顯比干粉藻油得率低，隨著料液比由1∶5增加到1∶25，藻油得率先快速上升，到1∶20之后藻油得率趨于穩定。隨著提取時間延長，藻油得率也逐漸增加，到12 h后趨于穩定，與三角褐指藻干粉提取藻油的趨勢一致。最終三角褐指藻藻泥的藻油得率在料液比1∶25、提取時間24 h條件下達到13.29%。

2.3 藻油中巖藻黃素含量

2.3.1 巖藻黃素的全波長掃描(見圖3)

由圖3可知，三角褐指藻DMCHA提取液顯示出巖藻黃素的特征吸收峰，最大的吸收峰在449 nm，可以確定提取液中主要成分為巖藻黃素。此外，在667 nm波長處有一個小的吸收峰，查閱文獻[16-17]可知，此處為葉綠素的特征峰，說明提取液中含有一定量的葉綠素。

圖3 巖藻黃素提取液全波長掃描

2.3.2 不同提取方法的巖藻黃素含量比較(見表1)

表1 氯仿甲醇法、DMCHA法、乙醇法提取藻油巖藻黃素含量比較 mg/g

由表1可以看出，DMCHA法提取的藻油巖藻黃素總含量為9.17 mg/g，與氯仿甲醇法總含量相差不大，證明其能較好地提取出巖藻黃素。相同提取條件下乙醇法提取的巖藻黃素總含量最高，與之前的研究相符[1]。可能是巖藻黃素溶出速率比較高，且乙醇對巖藻黃素的溶解度高。與氯仿甲醇法和乙醇法相比，DMCHA法提取的巖藻黃素異構體I含量最低，值得進一步探究其原因及改進措施來提高DMCHA對巖藻黃素的提取率。

2.4 提油前后三角褐指藻干粉的表面結構變化(見圖4)

A

B

由圖4A可知，提油前，三角褐指藻干粉具有規則的表面并且被油性物質覆蓋而沒有明顯的破壞。提油后(圖4B)，三角褐指藻干粉更加分散，且表面出現許多空隙，證明DMCHA破壞了三角褐指藻整體結構的完整性，從而增加了藻油的溶出。

2.5 DMCHA在藻油中的殘留(見圖5)

由圖5可知，在藻油層中存在19.861 mg DMCHA，相當于DMCHA添加量(10 mL)的0.231%。證明所提取的藻油溶劑殘留很低，分離效果很好。另外水層胺恢復成油溶性DMCHA之后經測定，溶劑回收率為93.2%，可以循環使用。

注：A為對苯二甲酸二甲酯的苯環上的氫峰，B為對苯二甲酸二甲酯的特征性甲基氫峰，C為DMCHA的特征性甲基氫峰，D為溶劑(D-14己烷)特征峰。

圖5 藻油中DMCHA殘留核磁圖

3 結 論

本文用可切換親水溶劑DMCHA從三角褐指藻干粉以及藻泥中提取藻油，與氯仿甲醇法提取的藻油中巖藻黃素總含量相差不大，低于乙醇法提取的藻油中巖藻黃素總含量。在室溫下，料液比1∶25提取24 h，三角褐指藻干粉藻油得率為21.29%，藻泥藻油得率為13.29%。因此，用干粉作為藻油的提取原料時提取效率更高。DMCHA溶劑的回收率為93.2%，藻油中DMCHA殘留量為DMCHA添加量的0.231%。