蛋黃卵磷脂中兩種溶血磷脂的分離與結構鑒定

王國財，袁 誠，唐順之,關偉鍵，牟肖男，牛亞偉，傅玉萍，許文東

(廣州白云山漢方現代藥業有限公司 中藥提取分離過程現代化國家工程研究中心，廣州 510006)

蛋黃卵磷脂是一種從雞蛋黃中精制而得的天然磷脂混合物，被廣泛應用于脂肪乳、脂質體等特殊注射劑中[1]。研究表明，蛋黃卵磷脂除了含有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)、磷脂酰肌醇(PI)外，還含有兩種微量的溶血磷脂，即溶血磷脂酰膽堿(LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)[2-5]。

蛋黃卵磷脂中的微量成分LPC和LPE具有較強的表面活性，在濃度較高時能夠使紅細胞膜破裂，引起溶血或細胞壞死。因此，中/長鏈脂肪乳注射液、丙泊酚注射液等脂肪乳制劑均將LPC、LPE作為影響其質量的主要雜質來控制[6-9]。目前，對于蛋黃卵磷脂中的LPC和LPE的含量測定有較多報道[2-5, 10]，但是對于其結構鑒定鮮有報道。

本文通過柱層析法對蛋黃卵磷脂中的LPC和LPE進行分離純化，利用核磁共振氫譜、碳譜，氣相色譜，ESI質譜等鑒定手段，最終確定LPC和LPE的結構，為蛋黃卵磷脂的質量研究及溶血磷脂在臨床及用藥安全方面提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

蛋黃卵磷脂(廣州白云山漢方現代藥業有限公司)，柱層析硅膠(青島海洋化工廠)，三氯甲烷、甲醇、三氟化硼、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉等均為分析純，棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、PC、PE、PI、SM、LPE、LPC等標準品均從Sigma-Aldrich公司購買。

1.1.2 儀器與設備

Bruker AVANCE AV 500超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀，Agilent 6890N氣相色譜儀，5973N質譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 LPC和LPE的分離純化

取1 kg蛋黃卵磷脂，加適量三氯甲烷溶解后，進行硅膠柱層析，用薄層板點板與標準品對比收集餾分，先用氯仿-甲醇(體積比5∶1)洗脫液進行洗脫，待第一個餾分(PE)洗脫完全后，收集第二個餾分，濃縮得LPE(8 g)。再用氯仿-甲醇(體積比3∶1)洗脫液進行洗脫，待第三個和第四個餾分(PC和SM)洗脫完后，最后用甲醇進行洗脫，收集第五個餾分，濃縮得LPC(30 g)。

1.2.2 ESI質譜條件

依據JY/T 003—1996《有機質譜分析方法通則》進行ESI質譜測定。電子能量70 eV，離子源溫度250℃，檢測器電壓1 200 V，儀器分辨本領為單位質量分辨，掃描范圍(m/z)50～2 000。

1.2.3 核磁共振氫譜和碳譜條件

依據JY/T 007—1996《超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜方法通則》進行核磁共振氫譜和碳譜測定。溶劑為氘代氯仿，氫譜內標為四甲基硅烷。

1.2.4 LPC和LPE脂肪酸組成檢測

1.2.4.1 甲酯化

取0.1 g樣品，置于50 mL錐形瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加4 mL庚烷，繼續在65℃水浴中加熱回流5 min后，放冷，加飽和氯化鈉溶液10 mL，搖勻，靜置分層，取上層液，用水洗滌3次，每次2 mL，上層液經無水硫酸鈉干燥后，用微孔濾膜過濾。備用。

1.2.4.2 氣相色譜條件

BPX-70毛細管脂肪酸分析柱(30.0 m×25 μm，0.25 μm)，柱溫190℃；進樣口溫度210℃；氫火焰離子化檢測器溫度300℃，氮氣流速1.2 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min。

2 結果與討論

2.1 LPC結構鑒定

2.1.1 LPC質譜及核磁數據

所分離得到的LPC性狀為白色粉末。

ESI-MSm/z:495.3，506.3，519.3，523.4；[M+H]+m/z：496.4，520.5，524.4；[M+Cl]-m/z：530.3，541.4，554.5，558.1。

1H-NMR(CDCl3,500 MHz):δ0.85～0.89(3H，m，H-a)，1.25(2H，m，H-b，H-g)，1.57(2H，m，H-h)，2.00～2.05(2H，m，H-c，H-f)，2.28～2.31(2H，m，H-i)，3.33(3H，s，H-p)，3.65(2H，m，H-o)，3.80+3.93(2H，m，H-m)，3.93(1H，m，H-l)，4.06～4.07(2H，m，H-k)，4.31(2H，m，H-n)，5.33～5.37(2H，m，H-d，H-e)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)：δ14.1(C-a)，24.9(C-h)，27.20(C-c，C-f)，22.7～31.9(C-b，C-g)，34.2(C-i)，54.2(C-p)，59.4(C-n)，65.2(C-k)，66.1(C-o)，67.1(C-m)，68.8(C-l)，127.9～130.2(C-d，C-e)，173.4(C-j)。

根據上述質譜及核磁信息可鑒定該化合物為LPC，其化學結構如圖1所示。

圖1 溶血磷脂酰膽堿(LPC)化學結構

2.1.2 LPC總脂肪酸檢測

通過與脂肪酸甲酯標準品保留時間對比分析，LPC中主要脂肪酸組成為棕櫚酸(55.38%)、硬脂酸(25.34%)、油酸(14.26%)、亞油酸(3.95%)、棕櫚油酸(1.08%)。

2.1.3 LPC結構確證

由于LPC化學結構上只有1個脂肪酸殘基，并通過脂肪酸組成確定了LPC含有5種脂肪酸成分，基本確立了LPC的5種可能結構構型，在此基礎上通過ESI質譜進一步確證，其質譜上顯示出m/z495.3、506.3、519.3、523.4主要的分子離子峰，表明LPC的化學結構為1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、1-亞油酰溶血磷脂酰膽堿、1-硬脂酰溶血磷脂酰膽堿、1-油酰溶血磷脂酰膽堿4種結構，其中以1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿為主。

2.2 LPE結構鑒定

2.2.1 LPE質譜及核磁數據

所分離得到的LPE性狀為白色粉末。

ESI-MSm/z:452.1，478.0，480.0；[M+H]+m/z：481.1。

1H-NMR(CDCl3,500 MHz):δ0.88(3H，m，H-a)，1.29(2H，m，H-b，H-g)，1.58(2H，m，H-h)，2.36(2H，m，H-i)，3.25(2H，m，H-o)，3.86+4.00(2H，m，H-m)，3.96(1H，m，H-l)，4.06～4.07(2H，m，H-k)，4.31(2H，m，H-n)，7.96(2H，m，H-p)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz):δ14.1(C-a)，22.7(C-b)，24.9(C-h)，27.20(C-c，C-f)，22.7～32.0(C-b，C-g)，34.0(C-i)，40.2(C-o)，62.2(C-n)，64.9(C-k)，67.1(C-m)，68.5(C-l)，173.4(C-j)。通過與LPC的氫譜碳譜進行比較可知，LPE并沒有氮甲基信號(δH3.33與δC54.2)，而且存在氮質子信號(δH7.96)。

結合質譜信息及核磁數據可鑒定該化合物為LPE，其化學結構如圖2所示。

圖2 溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)化學結構

2.2.2 LPE總脂肪酸檢測

通過與脂肪酸甲酯標準品保留時間對比分析，LPE中主要脂肪酸組成為棕櫚酸(22.41%)、硬脂酸(67.25%)、油酸(7.44%)。

2.2.3 LPE結構確證

由于LPE化學結構上只有1個脂肪酸殘基，并通過脂肪酸組成確定了LPE含有的3種脂肪酸成分，基本確立了LPE的3種可能化學結構，在此基礎上通過ESI質譜進一步進行確證，其質譜上具有m/z452.1、478.0、480.0分子離子峰，表明LPE的結構為1-棕櫚酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-油酰溶血磷脂酰乙醇胺3種結構，其中以1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺為主。

3 結 論

本文以柱層析分離法對蛋黃卵磷脂中兩種溶血磷脂(LPC和LPE)進行分離純化，采用ESI質譜、氣相色譜、核磁共振對其進行結構鑒定，最終確定蛋黃卵磷脂中的LPC具有1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、1-亞油酰溶血磷脂酰膽堿、1-硬脂酰溶血磷脂酰膽堿和1-油酰溶血磷脂酰膽堿4種結構，LPE具有1-棕櫚酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-油酰溶血磷脂酰乙醇胺3種結構。