哈維氏弧菌磷脂酶D對不同磷脂單分子層的吸附動力學研究

吳宗澤，陳華勇，楊 博，王永華，王方華

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006； 2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)(EC 3.1.4.4)是一類能水解磷脂質生成磷脂酸和羥基化合物的酶[1]。除了具有水解活性外，PLD還可通過磷酰基轉移作用催化磷脂質極性頭部基團的轉移反應，從而將大量磷脂酰膽堿(PC)催化合成為自然界稀有的磷脂質，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)等[2-3]。合成的磷脂質在食品、化妝品、藥品中具有重要應用價值[1]。目前，磷脂酶 D已成為合成和改造磷脂質的重要工具[1]。從催化反應過程看，無論是催化磷脂質水解反應還是磷酰基轉移反應，由于磷脂酶D的反應底物是不溶于水的磷脂，因此與脂肪酶類似，磷脂酶D也屬于界面酶。界面酶催化水解反應的進程大致可分為兩步，首先水中游離的酶蛋白在脂質底物存在的條件下，從水相聚集到“脂質-水界面”上。其次，脂質底物進入酶蛋白催化活性中心，發生相應的催化反應，生成目的產物[4]。已有研究表明，“磷脂質-水界面”的存在以及界面的質量對于磷脂酶D活力的充分發揮具有重要影響[5]。而界面吸附作為酶催化反應的首要步驟，在該過程中發揮著重要作用。但目前對于磷脂酶D而言，大部分研究集中在利用其進行特定結構磷脂的合成[3]，對于酶蛋白對脂質界面吸附特性的研究鮮有報道。

來源于哈維氏弧菌的磷脂酶D是新發現的一種酶，目前對于該酶的酶學特性尤其是該酶對不同磷脂底物的吸附動力學尚未見有相關報道。單分子層膜是目前公認的研究酶蛋白與脂質相互作用的經典模型[6]。基于單分子層技術可實現脂質單分子層-水界面特性的精準控制，從而為分子水平研究酶蛋白在磷脂質-水界面上的吸附動力學奠定基礎[7-9]。本研究首次利用單分子層技術研究該酶對不同磷脂底物的吸附動力學，以期深入了解該酶的界面吸附特性以及針對該酶進行開發與應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

L-α-磷脂酰膽堿(≥97%)、L-α-磷脂酰肌醇(≥99%)，L-α-磷脂酰絲氨酸(≥97%)，L-α-磷脂酰乙醇胺(≥99%)，L-α-磷脂酰甘油(≥98%)，均購于Sigma公司；氨芐抗生素、pET21a表達載體、誘導劑IPTG，均購于Invitrogen公司；質粒提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，購于上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

葡聚糖凝膠G-25柱(1 000～5 000 Da，1 cm×20 cm，GEHealthcare Bio-Science AB)，Q柱(5 mL預裝柱，嫁接葡聚糖的Seplite 6FF，配體—CH2N+(CH3)Cl-，粒徑50～150 μm，流速300～500 cm/h，工作溫度4～40℃，pH范圍2～12，儲存緩沖液20%乙醇，溫度4～8℃)，HYG-C型恒溫振蕩培養箱，JY92-IIN超聲破碎儀，Biologic LP蛋白層析儀(Bio-Rad 公司)，ELx800酶標儀(BioTek 公司)，Micro TroughX LB膜分析儀(配備有界面吸附專用反應槽，芬蘭Kibron公司)，DTCZ-240N SDS-PAGE電泳儀，Triple TOF 5600 LC-MS質譜儀(美國AB SCIEX公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 失活型哈維氏弧菌磷脂酶D大腸桿菌重組表達菌株的構建

首先，從NCBI蛋白數據庫中下載哈維氏弧菌磷脂酶D的完整蛋白序列(GenBank: WP_005435673.1)。用在線信號肽分析軟件SignalP 4.1 server對其信號肽進行分析預測。去掉N端24個信號肽氨基酸后的蛋白序列稱為成熟蛋白序列。編碼磷脂酶D成熟蛋白(VhPLD)的基因序列委托上海生工生物工程有限公司參照大腸桿菌密碼子偏好性進行優化，同時在優化的基因序列N端和C端分別添加NdeI和XhoI酶切位點并進行全基因序列的合成。合成的VhPLD基因用NdeI和XhoI內切酶酶切后連入用相同內切酶進行酶切的pET21a表達載體。將構建的質粒pET21a-VhPLD轉化大腸桿菌DH 5α 感受態細胞并進行測序驗證。為了避免酶水解磷脂從而對酶蛋白的吸附過程研究造成干擾，在已經構建的pET21a-VhPLD表達載體的基礎上進一步引入針對催化活性位點His157的單點突變(H157A)，從而使表達酶蛋白喪失水解活性。單點突變體的構建采用重疊延伸法進行。將構建的突變體pET21a-VhPLD-H157A轉化大腸桿菌DH 5α 感受態細胞并進行測序驗證。將測序正確的質粒進一步轉化到E.coliShuffleT7感受態細胞中，陽性克隆鑒定成功后，獲得失活型哈維氏弧菌磷脂酶D的大腸桿菌重組表達菌株。

1.2.2 失活型VhPLD的表達與純化

將重組表達菌株接種于5 mL含有氨芐抗生素的LB液體培養基(0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl)中，37℃下過夜培養，制備種子液。按5%接種量接種放大于含有氨芐抗生素的LB液體培養基中，37℃、200 r/min下培養2～3 h至OD600為0.6～0.8，加入誘導劑IPTG，至終濃度為0.05 mmol/L。調整培養溫度到20℃，繼續發酵培養24 h。將誘導表達后的發酵菌液離心(8 000 r/min，6 min，4℃)，去上清液，菌體用50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl (pH 8.0) 重懸，超聲破碎15 min，離心(10 000 r/min，15 min，4℃)，收集破碎上清，用0.45 μm濾膜過濾。將收集到的破碎上清液進行Ni2+親和層析。蛋白上樣后，用Buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)沖洗，緊接著用Buffer B(含有100～500 mmol/L咪唑的Buffer A)進行梯度洗脫，收集出峰的蛋白樣品。將100 mmol/L 咪唑梯度洗脫收集的出峰樣品用G-25柱脫鹽后，上樣Q柱陰離子交換層析，最終用含有300 mmol/L氯化鈉的緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脫得到目的蛋白樣品。所得到的蛋白樣品經SDS-PAGE電泳檢測其純度，用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定其蛋白濃度，用Triple TOF 5600 LC-MS(AB SCIEX)質譜儀進行LC-MS/MS鑒定分析。

1.2.3 VhPLD對不同磷脂單分子層吸附動力學參數測定

2 結果與討論

2.1 失活型哈維氏弧菌磷脂酶D的表達與純化

大腸桿菌表達系統相比于酵母表達系統，具有發酵周期短的優勢。考慮到所表達目的蛋白來源于哈維氏弧菌這一原核細胞，因此在構建VhPLD重組表達體系的選擇上，大腸桿菌表達系統成為本研究的首選。誘導表達后的電泳結果表明，雖然有部分目的蛋白以包涵體的形式存在于菌體破碎后的離心沉淀中，但破碎上清液中仍有部分可溶性蛋白存在。將破碎細胞上清液首先采用Ni2+親和層析純化，目的蛋白在含有100 mmol/L 咪唑的Buffer A 洗脫峰樣品中得以富集。洗脫峰樣品用G25柱脫鹽去除所含有的咪唑后，用Q柱陰離子交換層析對樣品作進一步純化。目的蛋白用含有300 mmol/L氯化鈉的50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)洗脫緩沖液洗脫。電泳結果(如圖1)表明，在54 kDa 左右處有明顯的條帶，蛋白大小與預期的結果類似(預測理論相對分子質量53 450.65 Da)。同時，取該蛋白條帶用Triple TOF 5600 LC-MS (AB SCIEX)質譜儀進行LC-MS/MS分析鑒定，確認該條帶即為要表達的目的蛋白。

注：1.蛋白marker；2.菌體破碎液；3.菌體破碎后離心所得上清液；4.菌體破碎后離心所得沉淀；5.鎳柱純化所得100 mmol/L咪唑洗脫峰樣品；6.鎳柱純化的上樣穿過峰樣品；7.G-25柱純化的洗脫峰樣品；8.Q柱純化的300 mmol/L氯化鈉梯度洗脫峰樣品。

圖1 失活型VhPLD的表達與純化SDS-PAGE電泳圖

2.2 VhPLD對不同磷脂單分子層的吸附動力學參數

單分子層最適合用來模擬細胞膜結構，基于此模型不僅可以研究界面酶分解脂質的動力學，還可以通過跟蹤脂質分子面積的變化來研究蛋白質在磷脂單分子層上的吸附動力學，其中脂質分子面積的變化直接由界面表面壓力的增加值(ΔΠ)進行精確監測[11-12]。磷脂分子是兩親性結構，由疏水性的酰基鏈尾端和一個極性頭所組成。當含有磷脂的氯仿溶液滴加到水相表面時，隨著氯仿有機溶劑的揮發，磷脂分子自然鋪展開來，隨即形成磷脂單分子層膜。單分子層技術正是基于該原理進行單分子層的制備，同時，利用高靈敏度探針精確測量磷脂單分子層的表面壓力變化。選取常見的幾種磷脂(PC、PE、PS、PG和 PI)，測量VhPLD對不同磷脂的吸附動力學參數。同時，嘗試比較不同初始表面壓力條件下，酶蛋白吸附動力學參數的變化。對于不同的磷脂單分子層，選定的蛋白濃度范圍為10～250 nmol/L，在不同的Πi下進行一系列的吸附動力學測定。

2.2.1 單一初始表面壓力條件下VhPLD對不同磷脂單分子層膜的吸附動力學參數

由于膜組分通常形成水不溶性單分子層，因此膜表面濃度被定義為單位面積上界面的物質量。膜表面壓力π被定義為水相表面張力(γ0)與薄膜覆蓋表面的表面張力(γf)之差，其中γ0為72.8 mN/m[13]。表面壓力是表征磷脂單分子層的一個重要的參數。Boisselier等[14]提出影響蛋白與脂質單分子層結合的因素有很多，如下相中緩沖液的組成、脂質膜的性質、蛋白的性質等。

在初始表面壓力為15 mN/m的條件下(見圖2)，VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附常數分別為(1.19±0.02)×104、(6.69±0.55)×103、(8.51±0.93)×103、(3.59±0.17)×103、(2.89±0.35)×103mol/(L·s)。VhPLD 對不同磷脂單分子層膜的吸附常數之間存在顯著性差異(P<0.05)，其中，吸附常數最大值出現在PC，最小值出現在PI。吸附常數值越大，表明酶蛋白越容易吸附到磷脂質-水界面上。VhPLD對PC、PE、PS的解離常數分別為(2.99±0.20)×10-3、(3.67±0.50)×10-3、(3.82±0.81)×10-3s-1，統計學分析表明3組數據之間無顯著性差異(P>0.05)。而VhPLD對于PG和PI的解離常數分別為(1.17±0.24)×10-3s-1和(1.77±0.48)×10-3s-1，統計學分析表明2組數據之間無顯著性差異(P>0.05)。然而，VhPLD對PC、PE和PS的解離常數與對PG和PI的解離常數之間存在顯著性差異(P<0.05)。解離常數越小，表明酶蛋白與磷脂結合越緊密，不容易從界面上解離下來，反之，表明酶蛋白越容易與磷脂分離。在初始表面壓力15 mN/m條件下，該酶對PC具有最大的吸附平衡常數((3.98±0.01)×106mol/L)，其次是PG((3.07±0.15)×106mol/L)，相反地，對于PE和PI的吸附平衡常數僅為(1.82±0.15)×106mol/L和(1.63±0.20)×106mol/L。吸附平衡常數反映的是酶對磷脂的親和力(或者是偏好性)大小，吸附平衡常數值越大，表明酶對磷脂的親和力越大，反之，親和力越小。以上結果表明，在初始表面壓力為15 mN/m的條件下，VhPLD對PC的親和力最強，而對于PE和PI的親和力最弱。在初始表面壓力15 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為PC>PG>PS>PE=PI。

圖2 初始表面壓力15 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數

在初始表面壓力為20 mN/m條件下(見圖3)，與VhPLD在初始表面壓力為15 mN/m條件下對不同磷脂的吸附常數趨勢相同，VhPLD對PC的吸附常數最大((1.57±0.19)×104mol/(L·s))，其次為PS((1.26±0.10)×104mol/(L·s))。VhPLD對PG和PI的ka值分別為(3.72±0.12)×103mol/(L·s)和(3.49±0.35)×103mol/(L·s)，均顯著低于其他磷脂底物。然而，在20 mN/m條件下，VhPLD對于PE的解離常數((8.48±1.31)×10-3s-1)明顯高于PC((3.80±1.40)×10-3s-1)和PS((4.26±0.97)×10-3s-1)，該結果與在15 mN/m條件下結果有較大差異。VhPLD對于PG和PI的吸附平衡常數分別為(5.43±0.02)×106mol/L和(5.12±0.05)×106mol/L。該結果表明在初始表面壓力20 mN/m條件下，酶對PG的親和力最大，其次為PI，而對于PE的親和力最小，吸附偏好性順序依次為PG>PI>PC>PS>PE。

在初始表面壓力為25 mN/m的條件下(見圖4)， VhPLD對PC的吸附常數最大((1.46±0.10)×104mol/(L·s))，對于PG((3.58±0.31)×103mol/(L·s))和PI((4.30±0.34)×103mol/(L·s))的吸附常數最小。在該初始表面壓力條件下，VhPLD對于PC、PE和PS的解離常數之間不存在顯著差異(P>0.05)，該結果與在15 mN/m所測定的結果保持一致。而在該條件下獲得的VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為PC>PS>PI>PE=PG。

圖3 初始表面壓力為20 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數

圖4 初始表面壓力為25 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數

2.2.2 不同初始表面壓力條件下VhPLD對單一磷脂的吸附動力學參數比較

相比于15 mN/m的初始表面壓力條件，VhPLD在20 mN/m和25 mN/m條件下對PC、PE和PS的吸附常數均顯著高于15 mN/m條件下相應的ka值(P<0.05)，VhPLD在20 mN/m和25 mN/m條件下ka之間卻沒有顯著性差異(P>0.05)。而對于PG而言，不同初始表面壓力條件下ka之間沒有顯著性差異(P>0.05)。相反的，VhPLD在25 mN/m條件下PI的ka與在15 mN/m和20 mN/m條件下均有顯著性差異(P<0.05)。

對于解離常數，除了在20 mN/m條件下對PE的kd值顯著高于15 mN/m和25 mN/m條件下外，其他磷脂底物在不同初始表面壓力下的kd值之間均沒有顯著性差異(P>0.05)。

不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力具有較大的影響。對于PC及PS而言，親和力隨著表面壓力的增加而逐漸增大，對于PE來說，其在20 mN/m條件下的親和力要顯著低于其他表面壓力條件下的值，主要原因是由于在此表面壓力條件下的kd值變大引起的。而對于PG和PI，最大的親和力出現在20 mN/m條件下，主要是由于在此條件下酶的解離常數降低所導致。

3 結 論

酶蛋白對于磷脂質-水界面的吸附動力學參數與磷脂單分子層的種類及不同初始表面壓力狀態密切相關。在15 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為磷脂酰膽堿>磷脂酰甘油>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰乙醇胺=磷脂酰肌醇；在20 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為磷脂酰甘油>磷脂酰肌醇>磷脂酰膽堿>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰乙醇胺；而在25 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序則轉變為磷脂酰膽堿>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰肌醇>磷脂酰乙醇胺=磷脂酰甘油。該結果提示在表征酶對不同磷脂吸附動力學參數的時候，必須要強調所處的表面壓力條件，否則單純評價對于不同磷脂的吸附動力學參數是沒有意義的。