過量表達OsDTH11基因對水稻穗發育和花粉育性的影響

靳亞軍，石雨鷺，邳瑞雪，王 荃，孔曉聰，梁閃閃，張泗舉，欒維江

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

水稻從營養生長向生殖生長轉變，即水稻的成花轉變對其開花結實至關重要，直接決定水稻的產量.水稻的開花結實受到內源基因和外界環境的共同作用，溫度和光照是決定開花的2個外界環境因子.光照促使植物形態結構的建成，并且促進植物開花[1-2].水稻是典型的短日照、長夜植物，延長黑暗時間會加速水稻的抽穗開花.當植物葉片接收到光信號時，會產生成花素物質，通過莖韌皮部運輸到莖頂端分生組織，從而誘導植物開花[3].研究表明，水稻的成花素基因Heading date 3a（Hd3a）在葉片接受光信號時表達上調，移動到莖頂端分生組織，首先進入莖頂端分生組織細胞質中，與成花素受體14-3-3蛋白相互作用形成Hd3a-14-3-3復合物，該復合物進一步轉移至細胞核中，與含有bZIP結構域的轉錄因子OsFD1相互作用形成成花素三元復合物，調控下游成花特性基因OsMADS14 and OsMADS15的表達，從而促進開花[4].Hd3a是擬南芥Flowering Locus T（FT）的同源基因，可編碼成花素，白天表達量較高，黎明時表達量達到最高峰.OsMADS14和OsMADS15是擬南芥APETALA1（AP1）的同源基因，對花器官的正常發育至關重要[4-5].

在水稻開花時間的調控上，短日照條件下（Short day，SD），Heading date 1（Hd1）正向調控成花素Hd3a的表達，從而促進水稻開花；長日照條件下（Long day，LD），Hd1抑制Hd3a的表達，從而抑制水稻開花.因此成花素上游調節因子Hd1具有雙重功能[6]，在SD和LD條件下功能相反.另一條關鍵的調控通路是水稻中獨有的，Early heading date 1（Ehd1）編碼B型應答效應因子，受藍光誘導表達，SD條件下能夠促進Hd3a的表達，從而促進水稻開花.LD條件下，由于上游基因Grain number、Plantheight和Headingdate7（Ghd7）抑制Ehd1的表達，從而下調Hd3a的表達，最終抑制水稻開花，延遲抽穗[7].

水稻基因組中，預測的成花轉變基因至少有19個，它們屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白基因家族（Phosphatidyl ethanolamine-bindingprotein，PEBP），該基因家族又分為Terminalflower1（TFL1）-like、Floweringlocus T（FT）-like、和Mother of FT and TFL1（MFT）-like 3個亞家族[8].在預測的19個成花轉變基因中，除Hd3a、RFT1、RCN1和RCN2的功能已知外[7-10]，其他基因的功能尚不明確.為了探究成花轉變基因OsDTH11的功能，本研究利用反向遺傳學方法，構建OsDTH11的過表達載體并轉化水稻，獲得了過表達轉基因植株.通過對轉基因植株和野生型植株表型的比較，揭示過量表達OsDTH11對水稻開花的影響.

1 材料和方法

1.1 材料

粳稻品種中花11（Oryza sativaL.ssp.Japonicacv.Zhonghua11）及其轉基因植株均種植于天津師范大學試驗田，田間常規管理.

1.2 儀器和試劑

儀器：梯度PCR儀（9902）和實時定量PCR儀（7500），美國Applied Biosystem公司；水平電泳槽（BG-power-600），北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像儀（Molecular Imager?Gel DocTM XR），美國BIO-RAD公司.

試劑：G418、卡那霉素、利福平、羧芐青霉素、頭孢霉素等抗生素，上海生物工程有限公司；質粒小提取試劑盒（D6943-01），天根生物科技（北京）有限公司；PCR凝膠純化試劑盒，美國OMEGA Bio-Tek公司；普通DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、Real-time PCR相關試劑及反轉錄酶，南京諾維贊生物科技有限公司.所有引物均由中美泰和生物技術有限公司與通用生物系統（安徽）有限公司合成，測序由中美泰和生物技術有限公司完成.

1.3 OsDTH11過表達載體的構建

從短日照條件處理60 d的水稻中提取葉片總RNA，用M-MLV反轉錄酶反轉錄獲得cDNA作為擴增OsDTH11目的基因的模板.設計特異性引物進行PCR擴增，獲得OsDTH11的全長ORF（開放閱讀框）片段.PCR擴增程序為：95℃，1 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，運行35個循環；72℃，7 min.對產物進行凝膠電泳，切膠回收，純化PCR擴增的目的片段.用相應的限制性內切酶SmaI和PstI對目的片段和pCAMBIA2300載體分別進行酶切，純化回收.將目的片段連入pCAMBIA2300載體，構建成重組載體，并對其進行測序確認.

1.4 OsDTH11基因的組織特異性表達分析

對目的基因的組織特異性表達進行分析.田間收集野生型植株的不同組織器官，包括分生組織、葉、根和穗，提取總RNA，反轉錄獲得cDNA.利用OsDTH11基因的特異性引物進行半定量PCR擴增，分析目的基因在不同組織器官中的特異性表達.

1.5 過表達轉基因植株的表達檢測

取移栽后34 d的對照植株和轉基因植株葉片，采用Trizol試劑提取葉片總RNA，用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄得到cDNA作為半定量PCR擴增的模板，檢測目的基因OsDTH11的表達.擴增程序為：95℃，1 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，運行30個循環；72℃，7 min.以OsActin基因作為內參進行相對定量分析.

1.6 實時定量PCR分析

使用去基因組酶（Primer ScriptTMRT reagent kit with gRNA Eraser）反轉錄對照植株和轉基因植株各個株系的總RNA，獲得的cDNA作為模板，用OsDTH11特異性檢測引物進行實時定量PCR擴增.反應程序為：95℃1min；95℃20 s，58℃1min，運行40個循環；95℃15 s；60℃60 s；95℃15 s.按照Livak等[11]的2-ΔΔCt方法進行數據處理，以OsActin基因作為內參進行定量分析.

1.7 花粉育性鑒定

采用碘染法進行花粉育性鑒定.從開花前1~2 d或即將開花的過表達植株中收集所調查的穎花，從不同獨立株系主莖穗的上、中、下部共取得20~30朵穎花，分別固定于75%（體積分數）乙醇溶液中，4℃冰箱保存.鏡檢時，用解剖針將同一朵穎花的6枚花藥取出放置于載玻片上，滴1滴1%（質量分數）的I2-KI，用鑷子將花藥夾碎，釋放出成熟花粉，小心去除花藥壁殘渣，蓋上蓋玻片置于光學顯微鏡下觀察，根據花粉染色狀況判斷花粉育性.可育花粉呈圓形，大而飽滿，著色深且均勻.不育花粉包括染敗型、圓敗型和典敗型3類：染敗型花粉小，染色不正常，有不同程度著色；圓敗型花粉仍為圓形，部分染色；典敗型花粉形狀皺縮不規則或呈圓形，無內含物，對I2-KI無染色反應.每個穎花觀察3個視野，保證花粉粒數量超過200粒，計算花粉育性.花粉育性（%）=可育花粉粒數/總花粉粒數×100.最終花粉育性為3個視野育性的平均值.

2 結果與分析

2.1 OsDTH11過表達載體的構建

為了研究OsDTH11的功能，首先構建其過表達載體，利用2個串聯的35S強啟動子驅動目的基因的表達.過表達載體的結構如圖1（a）所示，LB為T-DNA左邊界，NPTⅡ為新霉素磷酸轉移酶抗性的篩選標記，p2×35S為2個串聯的花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子，RB為T-DNA的右邊界.提取短日照條件下水稻葉片的總RNA，經反轉錄獲得cDNA，用OsDTH11特異性引物通過RT-PCR擴增獲得目的基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，證實獲得的片段大小與預期設計相符，如圖1（b）所示.將目的片段和pCAMBIA2300空載體連接，轉化后獲得重組載體，取重組質粒進行酶切鑒定，可以切出目的條帶，如圖1（c）所示，說明目的片段已成功連入空載體中.進一步對重組質粒進行測序分析，結果表明其序列與參考序列一致，沒有突變，可以進行后續轉基因實驗.

圖1 過表達載體的構建Fig.1 Construction of overexpression vector

2.2 OsDTH11基因的組織特異性表達分析

為了探究OsDTH11基因的功能，分別提取水稻分生組織、葉、根和穗的總RNA，反轉錄合成cDNA，利用半定量PCR分析目的基因在水稻不同器官中的表達情況，結果如圖2所示.由圖2可以看出，OsDTH11在各個組織中均有表達，在穗中表達量很高，在分生組織、葉片和根中表達較弱.這一結果暗示OsDTH11可能在水稻穗的生長發育過程中具有重要作用.

圖2 OsDTH11基因的組織特異性表達分析Fig.2 Tissue-specific expression of OsDTH11 gene

2.3 過表達轉基因植株的表達分析

分析OsDTH11基因在野生型水稻植株中的表達情況，結果表明，該基因在水稻中的表達豐度很低.由于OsDTH11基因屬于PEBP基因家族，在水稻基因組中成員較多，單個目的基因的敲除或功能缺失突變體較難獲得預期表型，因此本研究采用過量表達方法對OsDTH11基因的功能進行探索.通過農桿菌介導的遺傳轉化，經愈傷組織誘導、繼代、農桿菌侵染、抗性愈傷的篩選、分化、生根過程，最終獲得15個獨立株系的113株T0代過表達轉基因植株.轉基因植株移栽大田生長健壯后，收集葉片提取總RNA進行表達分析.分別從每個株系隨機抽取3~5個單株進行表達分析，以空載體轉基因植株作為對照，結果如圖3所示.

圖3 OsDTH 11過表達轉基因植株的表達分析Fig.3 Expression analysis of transgenic plants overexpressing OsDTH11

從圖3（a）可以看出，和空載體轉基因對照植株（CK1和CK2）相比，46株過表達轉基因植株中，有45株有不同程度的過量表達.其中，L1、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L11、L12和L13株系過表達程度很強，L2、L3、L10、L14及L15株系過表達程度較弱，但均高于空載體轉基因對照植株.為了更精確地分析轉基因植株中OsDTH11的表達，根據半定量RT-PCR結果，選取了部分有代表性的轉基因株系進行實時定量PCR分析，結果如圖3（b）所示.與對照植株相比，L1和L4的過表達程度是對照植株的上萬倍，L5、L7過表達程度是對照植株的6 000倍；L2的過表達程度較弱，是對照植株的356倍.這些結果與半定量PCR結果相吻合，說明過表達載體正常工作，起到了過量表達的作用.

2.4 過表達轉基因植株表型的分析

對獲得的轉基因植株表型進行田間觀察，發現同導入pCAMBIA2300空載體的轉基因對照植株相比，OsDTH11過表達轉基因植株結實率降低，空癟粒數較多，如圖4（a）和圖4（b）所示.15個獨立株系中，有2個株系表現為不同程度的穗發育不良，小花出現退化現象，如圖4（c）和圖4（d）所示.對照植株花粉染色正常，如圖4（e）所示.在不育花粉中，典敗型花粉居多，圓敗型花粉次之，染敗型花粉最少，如圖4（f）所示.調查花粉育性發現，對照植株花粉幾乎全部可育，而過表達轉基因植株的花粉育性明顯下降，其中L5的育性為98%，L6的育性為51%，L12的育性為58%，如圖4（g）所示.

圖4 OsDTH11過表達轉基因植株的表型Fig.4 Phenotype of transgenic p lants overexpressing OsDTH11

2.5 過表達轉基因植株的農藝性狀分析

田間測量統計13個獨立過表達轉基因株系的抽穗期（Heading date）、株高（Plant height）、穗長（Panicle length）和結實率（Seed setting rate），結果如圖5所示.同空載體轉基因對照植株相比，13個獨立過表達株系的結實率均有不同程度的降低，L1和L7的結實率最低，分別為43%和29%，如圖5（a）所示；多數株系的抽穗期與對照植株相近，如圖5（b）所示；大部分轉基因株系的株高與對照植株相比沒有明顯差異，但L7的株高明顯變矮，如圖5（c）所示；除L10株系的穗長大于對照植株外，其他過表達轉基因株系的穗長均明顯小于對照植株，如圖5（d）所示.這些結果表明，過量表達OsDTH11導致水稻小穗及花發育不良，造成穗長變短，結實率下降，但并不影響水稻的抽穗開花時間.

圖5 OsDTH 11過表達轉基因植株農藝性狀分析Fig.5 Agronom ic traits of transgenic plants overexpressing OsDTH11

3 討論與結論

水稻成花基因家族中，Hd3a和RFT1參與不同的光周期調控通路，過量表達這2個基因都會加速水稻的抽穗開花時間.不同的是，Hd3aRNAi轉基因植株在短日照條件下推遲開花，而RFT1RNAi轉基因植株在長日照條件下推遲開花，Hd3a和RFT1同時進行RNAi干擾后植株表現為不開花.這些結果表明，Hd3a和RFT1與水稻抽穗期有關，二者會調節水稻的抽穗開花時間[9-10].同一家族的OsDTH11在過量表達后，抽穗期與對照植株沒有明顯差別，但結實率明顯降低，穗及花的發育受到了影響.因此推測OsDTH11基因參與了生殖細胞的發育過程：一方面，它可能與生殖細胞的形成和育性有關：另一方面，可能和授粉后胚的發育有關，過表達會產生不正常的胚結構，導致癟粒和空粒較多.

組織特異性表達分析結果表明，OsDTH11基因在幼穗中高表達，但在葉片中表達較低，這與開花時間基因的表達有所不同.與開花時間相關的基因在葉片中有較高的表達，因為這些基因首先要在葉片中感受光的刺激，識別光暗變化，這也說明OsDTH11可能與開花時間關系不大.此外，本研究對OsDTH11的啟動子序列進行分析，發現其啟動子序列中含有花粉特異表達元件和花粉調控元件，推測OsDTH11可能與花粉的發育相關.水稻雄配子體（花藥）的發育過程可分為2個階段：第一個階段是花藥的形態建成，包括孢原細胞經過造孢細胞發育為孢母細胞（花粉母細胞）的過程和花粉母細胞的減數分裂過程；第二個階段是花粉的形成，包括小孢子的有絲分裂、花粉粒的成熟與釋放等[12].在這些發育進程中，有許多基因參與調控：GEM1編碼微管結合蛋白MOR1，在細胞質中通過結合微管參與成膜體的形成[13]；TDR編碼1個具有螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子，主要在絨氈層細胞中表達[14]；RA68編碼一個N末端有22個氨基酸殘基和幾個翻譯后修飾位點而C末端序列相對保守的蛋白，它參與減數分裂后的小孢子的發育[15].本研究結果表明，過量表達OsDTH11降低了花粉育性，因此，OsDTH11可能與這些基因間存在直接或間接的相互作用，從而控制花粉的育性，具體和哪個基因相互作用，還有待進一步實驗驗證.

不正常的胚胎發育也會導致籽粒發育不良，降低結實率.本課題組后期將對過表達轉基因植株不同時間段發育的胚進行縱切，觀察其是否與野生型有差異.同時，為了更明確揭示OsDTH11基因的功能，將構建其CRISPR基因編輯載體，獲得OsDTH11-CRISPR編輯突變體，觀察OsDTH11被敲除后的表型特征及功能.