白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3的生物信息學分析

相偉芳，楊藝新，郭美琪，張新玥，李 敏，潘麗娜

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

美國白蛾Hyphantriacunea（Drury）又名美國燈蛾，屬鱗翅目（Lepidoptera）燈蛾科（Arctiidae）[1]，具有食性雜、繁殖量大及適應性強等特點，是一種對林業和農業造成嚴重危害的世界性檢疫害蟲[2].1979年，美國白蛾首次在我國被發現，隨后擴散到我國的其他地區并造成嚴重危害[3-4].為了減輕美國白蛾的危害，楊忠岐[5]連續多年對該害蟲的天敵進行調查，最終在陜西地區發現了一種新的美國白蛾寄生蜂—白蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cuneaYang）.白蛾周氏嚙小蜂屬姬小蜂科（EuloPhidae）嚙小蜂屬（Tetrastichus），是美國白蛾蛹期的重要寄生性天敵[6]，在控制美國白蛾的數量方面起著重要作用.目前，白蛾周氏嚙小蜂已經被廣泛應用于美國白蛾的防治中并取得顯著成效[7].白蛾周氏嚙小蜂主要通過嗅覺系統定位寄主.昆蟲的嗅覺系統主要包括氣味結合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）、化學感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）、神經元膜蛋白（Sensoryneuronmembraneproteins，SNMPs）及氣味受體（Olfactory receptors,ORs）蛋白等[8].氣味分子進入感器淋巴液中，與淋巴液中的氣味結合蛋白結合，激活嗅覺神經元膜上的氣味受體，產生動作電位，從而引起一系列的行為反應[9].氣味結合蛋白可以與氣味分子特異結合，對氣味分子起到初步的過濾作用，是昆蟲嗅覺識別過程中關鍵的一步.因此，OBPs與氣味分子的結合是本領域的研究熱點.關于白蛾周氏嚙小蜂對美國白蛾氣味識別的研究已有一些報道.如Zhao等[10]首次對雌雄白蛾周氏嚙小蜂的觸角進行了測序，共測定出25個氣味結合蛋白、80個氣味受體、10個離子受體（Ionotropic receptors，IRs）、11個化學感受蛋白、1個神經元膜蛋白和17個味覺受體（Gustatory receptors，GRs）.Zhu等[11]對美國白蛾蛹、老熟幼蟲和蟲糞的揮發物進行了檢測，共測定出了18種化合物.趙燕妮等[12]和張新玥等[13]在此基礎上分別對氣味結合受體CcOR83b和CcOR1進行了分子進化分析.王鳳竹等[14]對氣味結合蛋白CcOBP1進行了進化分析.

分子對接技術是近年來被應用于昆蟲嗅覺研究的生物分析技術，它通過構建蛋白質與小分子化合物的三維結構，將小分子匹配到蛋白質的結合位點上，通過計算結合力來篩選與蛋白結合的小分子物質[15].如Li等[16]利用分子對接技術研究了中華蜜蜂（Apis cerana）的化學感受蛋白CSP1；Du等[17]利用該技術探究了含雜環的（E）-β-法尼烯類似物與蚜蟲氣味結合蛋白的結合模式.

目前，對于白蛾周氏嚙小蜂嗅感蛋白的研究較少.本研究選取白蛾周氏嚙小蜂雌雄觸角均大量表達的一個氣味結合蛋白CcOBP3，通過軟件預測及分子對接技術，對CcOBP3進行多角度分析，為探明CcOBP3的結合特性提供理論基礎，也為后續的白蛾周氏嚙小蜂嗅覺機制的研究積累數據.

1 材料與方法

1.1 Cc OBP3序列分析

1.1.1 材料

CcOBP3堿基序列由本課題組前期通過轉錄組測序技術對雌雄白蛾周氏嚙小蜂的觸角進行測序獲得[10].選取美國白蛾蛹、老熟幼蟲和蟲糞的揮發物以及常見的植物揮發物共8種小分子物質用于CcOBP3的分子對接.美國白蛾的揮發物[11]包括：鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，C10H10O4）、正戊醛（Valeraldehyde，C5H10O）、十六烷（n-Hexadecane，C16H34）、正十五烷（n-Pentadecane，C15H32）、正十四烷（Etradecane，C14H30）.植物揮發物[18-20]包括：苊（Acenaphthene，C12H10）、3-蒈烯（3-Carene，C10H16）和丁酸丁酯（n-Butylbutyrate，C8H16O2）.

1.1.2 方法

應用Bio Edit分析CcOBP3序列的氨基酸殘基數及相對分子質量；EXPASY平臺中的SignalP3.0 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于預測信號肽 及其 所在位 置；HMMTop（http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）用于預測蛋白的跨膜結構域.

1.2 分子對接

1.2.1CcOBP3同源建模及模型評價

將CcOBP3的氨基酸序列作為建模模板，在Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）上對CcOBP3進行同源建模[21]，獲得蛋白的三維結構.用Ramachandran圖評價CcOBP3蛋白三維結構的質量[22].

1.2.2CcOBP3分子對接

美國白蛾揮發物以及常見的植物揮發物共8種小分子物質用于CcOBP3的分子對接.從Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載8種小分子的三維結構[23]，準備進行分子對接.首先用Schrodinger Suites 2015-2中的maestro10.2軟件將CcOBP3的三維結構導入，手動輸入蛋白三維結構具體坐標并進行調整，盡可能使蛋白的活性中心位于盒子的中心，生成文件保存.然后導入8種小分子物質的結構，搜索小分子物質的其他構象，生成文件保存.最后用maestro10.2進行分子對接，Pymol v1.3顯示對接結果.

2 結果與分析

2.1 CcOBP3序列分析結果

CcOBP3的開放閱讀框為453 bp，編碼150個氨基酸，相對分子質量為16 747.90.軟件預測該蛋白有信號肽，位于第28~29位氨基酸殘基之間，如圖1所示.CcOBP3含有一個跨膜結構域，位于第7~23位氨基酸殘基上.

圖1 Cc OBP3的信號肽位置預測結果Fig.1 Prediction results of Cc OBP 3 signal peptide position

2.2 CcOBP3分子對接結果

2.2.1CcOBP3同源建模結果

利用Swiss-Model在線搜索白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3最佳模型的模板.結果表明，意大利蜜蜂（Apis mellifera）的氣味結合蛋白OBP5（ID:3r72.1）與白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3的相似度最高，為36.75%.一般來說，模型的相似度在30%以上便可獲得相對合理的構象[24].因此，意大利蜜蜂的氣味結合蛋白OBP5可作為白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3的模板，通過Swiss-Model構建白蛾周氏嚙小蜂CcOBP3的結構模型.

白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3的三維結構有6個α螺旋，分別為Arg32-Thr51（α1）、Leu54-Asn63（α2）、Pro69-Leu81（α3）、Ala93-Ile102（α4）、Ile108-Val116（α5）、Pro128-Glu142（α6），如圖2所示.

圖2 白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白Cc OBP3的3維結構Fig.2 3D structure of odorant binding protein Cc OBP3 of Chouioia cunea

CcOBP3拉式構象的分析結果如圖3所示.由圖3可以看出，97.5%的CcOBP3氨基酸殘基落在最佳區域（藍色區域），1.7%的氨基酸殘基落在較合理區域（紫色區域），只有0.8%的氨基酸殘基落在不允許區域（白色）.有97.5%的CcOBP3氨基酸殘基落在最佳區域，大于90%，說明該蛋白模型較為合理.

圖3 Cc OBP3 3維模型的拉氏構象評價Fig.3 Rational evaluation of the established 3D model of Cc OBP3 by Ramachandran plot

利用PROSA（https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）對同源建模所得蛋白質結構模型進行能量評價，評價結果如圖4所示.由圖4可以看出，Z-score值為-5.82，一般Z-score為負值就表示此蛋白的結構模型是合理的.經2種方法對CcOBP3模型進行評價，確認CcOBP3經同源建模獲得的模型構象合理，可以用于后續的分子對接.

圖4 Cc OBP3蛋白整體模型質量Fig.4 Overall quality of Cc OBP3 model

2.2.2CcOBP3與小分子物質的對接結果

用maestro10.2軟件計算CcOBP3與8種小分子物質的結合能量.對接完成后，得到各個化合物與CcOBP3結合的結合常數，如表1所示.結合常數的絕對值越大，說明CcOBP3與該化合物結合所需的自由能越少.根據分子對接結果，3-蒈烯與CcOBP3的結合特性最大，美國白蛾的揮發物成分鄰苯二甲酸二甲酯和正戊醛也與CcOBP3有較強的結合特性.

表1 可能與Cc OBP3結合的化合物及結合常數Tab.1 Compounds and binding constants that may bind Cc OBP3

CcOBP3與3-蒈烯主要通過范德華力等進行結合，具體結合過程如圖5所示.CcOBP3的Met-96、Val-139、Phe-148和Phe149與3-蒈烯通過碳磷鍵結合；Pro-150、Phe-135、Met-79和Ile-100與3-蒈烯通過碳碳鍵結合；Met-82、Thr-84、Gln-99、Met-103、Val-104和Thr136通過范德華力結合.

圖5 Cc OBP3與小分子化合物對接結果Fig.5 Docking results of Cc OBP3 with small molecule compound

3 討論與結論

CcOBP3是在白蛾周氏嚙小蜂觸角中大量表達的一個氣味結合蛋白.本課題組前期通過轉錄組測序技術獲得了CcOBP3的cDNA全序列，用Bio Edit、EXPASY平臺中的SignalP3.0 Serve和HMMTop軟件分析了CcOBP3的堿基序列，結果表明，CcOBP3具有昆蟲氣味結合蛋白的典型特征，即相對分子質量小、有6個保守的半胱氨酸位點，在N端有信號肽.

分子對接技術是基于計算機模擬技術，通過構建蛋白和小分子化合物的三維構象，將小分子匹配到蛋白質的結合位點上進而評估結合力強弱的一種生物分析技術.利用分子對接技術，針對白蛾周氏嚙小蜂的CcOBP3在美國白蛾蛹等的揮發物中篩選能夠與之結合的物質，最終得到與CcOBP3特異結合的化合物，明確CcOBP3的結合特性.利用Swiss-Model在線搜索建模，結果表明，意大利蜜蜂的氣味結合蛋白OBP5（ID:3r72.1）與白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3的相似度最高.Rama-chandran和PROSA能量評價結果均表明模型構象合理.分子對接的結果表明，白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3可能與3-蒈烯結合.3-蒈烯是精油中單萜烯的主要組分，具有強烈的松木樣香.據報道，3-蒈烯對一些昆蟲具有吸引作用.例如，3-蒈烯對紅脂大小蠹具有一定的吸引作用[25]；3-蒈烯對花絨寄甲也有明顯的引誘作用[26].因此推測CcOBP3的功能與引誘作用相關.

本研究通過軟件分析和分子對接技術對白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP3進行了多角度的預測分析，為CcOBP3的后續研究和進一步探明白蛾周氏嚙小蜂的嗅覺機制積累數據.