DDX6突變體的構建

周焱琳 唐翠蘭 于秀芝

RNA解旋酶在多條RNA代謝通路中起到調控作用。在復雜的細胞環境中，它們可與細胞內多種信號通路、蛋白相互作用，參與調控致癌基因或抑癌基因的表達，參與癌癥的發生發展。人類細胞表達約70種RNA解旋酶，大多數屬于超家族2（superfamily 2，SF2）[1-2]。SF2 包括了 DEAD-box RNA 解旋酶（DEAD-box RNA Helicase，DDX RNA Helicase，DDX）蛋白家族，DDX蛋白是一類在進化中高度保守的ATP依賴的RNA解旋酶，廣泛分布于人體的各個組織和器官中，包括肝、腎、心臟、結腸、闌尾、皮膚、唾液腺等等（數據來自 GioGPS，ID：1656）。它參與調節 RNA的多個過程，包括mRNA前體加工、RNA降解、翻譯啟動、轉錄調控等[3]。其家族蛋白的結構分為N端區、C端區和核心區。核心區位于N端區和C端區之間，包含9個保守結構域，包括該家族特征性氨基酸序列，即天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（D-E-AD）。由于家族成員在N端區和C端區結構域存在差異，導致其功能也出現了差別。有研究表明，家族中的DDX6在許多惡性細胞系中高度表達，其表達與癌癥細胞的生長和分化密切相關。DDX6可在大腸癌、肝癌、胃癌中高度表達。它可以通過增加胃癌細胞中c-Myc表達來促進胃癌進展[4]。此外，它對膠質細胞瘤也有促進作用[5]。沉默DDX6，可以抑制結腸直腸癌細胞體外和體內的增殖[6]。人源DDX6又名RCK/p54，可從B細胞淋巴瘤細胞系RC-K8中克隆而來，其蛋白分子量為54kDa[7]。為了進一步明確DDX6在癌癥進展過程中的作用，我們構建了DDX6突變體，使其失去解旋酶活性，或同時失去解旋酶和ATP酶活性，以期在后期實驗中深入研究其生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材 料 質粒載體和菌株：DDX6-WT和pENTER購自維真生物科技公司（批號CH867745、PD88001）。細胞株：人肝癌Huh7細胞系由本實驗室保存。

1.2 試 劑 DH5α感受態細胞購自Simgen（8301010/8301020）；QIAGEN Plasmid Midi Kit 和QIAquick Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司（批號12145、28704），PCR引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。Pro Ligation-Free Cloning Kit購自 abm 公司（批號 E086）。PrimeSTAR Max DNA Polymerase，DL15，000 DNA Marker和 DL5000 DNA Marker購自 Takara公司（批號 R045Q、3582Q、3428Q）。瓊脂糖購自 BIOWEST（批號 111860）。LB 肉湯培養基、LB肉湯瓊脂購自生工生物（批號A507002-0250、A507003-0250）。Pierce BCA Protein Assay Kit、AsiSI和 MLμL 購自 Thermo Fisher Scientific （批 號 23225、FD2094、FD0564）。Lipofectine 3000和P3000購自美國Invitrogen（批號L3000015）。DMEM培養基購自Hyclone公司（批號SH30022.01）。胎牛血清、Opti-MEM培養基購自 Gibco（批號10099141、31985062）。0.25%胰酶+0.02%EDTA 溶液購自吉諾生物（批號GNM25200）。SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術（批號P0012A）。Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse、Dimethyl sμLfoxide （DMSO） 購 自 sigma-Aldrich（批號 F1804、V900090）。GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb購自Cell Signaling Technology（批號2118S）。Goat Anti-Mouse IgG （H+L）HRP 和 Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP購自聯科生物（批號70-GAM007、70-GAR007）。

1.3 方 法

1.3.1 突變質粒的構建 DDX6-EQ突變質粒的構建：以DDX6-WT為模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和突變引物擴增整個模板。DDX6-EQ 突變上游引物（5’-3’）：TCCAGATGATAGTATTGGATCAGGCAGATAAGTTGCTGTCACAGGA；下游引物（5’-3’）TGACAGCAACTTATCTGCCTGATCCAATACTATCATCTGGACATGA。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，回收產物使用Pro Ligation-Free Cloning Kit試劑盒進行連接。連接產物命名為DDX6-EQ。DDX6-△C突變質粒的構建：以DDX6-WT為模板，使用AsiSI/MLμL進行雙酶切，獲取約1.4kb的目的片段和約7.5kb的載體片段。使用突變引物擴增目的片段，DDX6-△C突變上游引物（5’-3’）：TCCGGTACCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCCATGAGCACGGCCAGAACAGAGAAC；下游引物（5’-3’）：CCTTATAATCCTCGAGCGGCCGCGTACGCGTCAGGTTAATCTCATAGGG。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約0.9kb的片段，回收產物和載體片段使用Pro Ligation-Free Cloning Kit試劑盒進行連接，連接產物命名為DDX6-△C。

1.3.2 突變體的篩選與序列分析 將突變后的質粒轉入感受態細胞，在含有卡納抗性的LB平板上涂板，37℃過夜后，挑取單菌落于37℃震蕩培養過夜，提取質粒。將克隆子送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行雙向測序，并對測序結果使用NCBI網站的BLAST平臺進行核實。

1.3.3 突變體酶切鑒定 用AsiSI和MLμL對突變后的質粒進行雙酶切鑒定。起反應體系為：質粒DNA 1000ng，AsiSI 0.8μL，MLμL 0.8μL，10 ×Fastdigest buffer 2μL，ddH2O 補足 30μL。

1.3.4 細胞復蘇 溶液氮罐中取出Huh7細胞，37℃水浴，迅速融化細胞懸液。

1.3.5 細胞培養 細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中貼壁生長。細胞培養于37℃、含5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱內。每1天換一次液，每兩天用含0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液的消化液進行傳代。

1.3.6 細胞凍存 待細胞生長到一定密度后，消化重懸細胞。將細胞懸液轉移至15mL無菌離心管后，以800rpm的速度室溫離心3min。離心后去上清，加入 700μL DMEM，200μL 胎牛血清，100μL DMSO，吹打數次重懸后，轉移至無菌細胞凍存管中，于液氮中保存。

1.3.7 轉 染 將Huh7細胞在6孔板中以0.5×106個/孔的密度鋪板，24h后，當細胞融合率達50%～80%時，即可進行轉染。轉染前，將舊培養基棄去，加入新的血清培養基。將所需要的轉染試劑和質粒按照實驗量分別加入相應的Opti-MEM培養基中，輕柔吹打混勻，室溫孵育5min。將轉染混合物均勻逐滴加入細胞中，孵育48h。

1.3.8 蛋白質提取與蛋白印跡（Western Blot）分析使用RIRP裂解液提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，加入5×SDS Loading dye沸水浴10min變性。使用SDS-PAGE凝膠配置試劑盒配膠。將制備好的蛋白樣本加入膠中，恒壓電泳90V，當溴酚藍前緣達到分離膠時，調節恒壓電泳至120V，電泳直至溴酚藍達到膠底部。電泳結束后立即轉膜，恒壓電流330V，1h。轉膜結束后配5%BSA封閉液，室溫封閉2h，可適當延長。根據抗體說明書和目的蛋白信號強弱，用5%BSA稀釋一抗，一抗4℃孵育過夜。次日回收一抗稀釋液，TBST洗膜三次，每次10min后，根據二抗說明書和目的蛋白信號強弱，以合適比例稀釋二抗，二抗室溫孵育1h。再用TBST洗膜三次，每次10min后，采用ECL發光。觀察目的蛋白條帶強弱趨勢，分析實驗結果。

2 結果

2.1 突變質粒的構建與酶切鑒定 DDX6-WT由483個氨基酸組成,其C端帶有Flag和His標簽蛋白。根據突變位置，分別命名無解旋酶活性的突變體和同時無ATP酶、解旋酶活性的突變體為DDX6-EQ（堿基序列第739位堿基由G突變為C，導致蛋白質序列第247位的谷氨酸（Glu）突變為谷氨酰胺（Gln）），和DDX6-△C（C端截去編碼氨基酸的549個堿基，導致C端截去183個氨基酸）。突變體模式見插頁圖1。在表達載體pENTER的多克隆酶切位點上，DDX6-WT片段兩端對應的限制性核酸內切酶位點為AsiSI和MLμL。使用AsiSl/MLμL雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，得到一條約7.5kb的載體pENTER片段和目的片段。目的片段分別約為1.4kb，1.4kb 和 0.9kb，見插頁圖 2。

2.2 序列分析 將突變體送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行雙向測序，將突變序列在BLAST中進行比較，在Chromas中核實，達到預期設計，見插頁圖3。

2.3 細胞水平蛋白驗證 在蛋白質水平使用Western Blot檢測。將DDX6-WT和突變體分別轉染入Huh7細胞后，孵育48h，收獲細胞蛋白。Western Blot檢測可見 DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 蛋白。DDX-WT和DDX6-EQ蛋白分子量為54kD，DDX6-△C蛋白分子量為34kD。符合預期，提示能正常表達相對應的蛋白，再次證實DDX6突變體構建成功，見插頁圖4。

3 討論

RNA在許多細胞過程中發揮著重要作用，包括mRNA的剪切，核糖體生物合成和翻譯。RNA分子擁有特異性二級和三級結構，盡管這些結構在調節RNA功能上發揮著至關重要的作用并引導著基因表達的調節，mRNA仍需要具有恰當結構的輔助分子來發揮其功能。特別是復雜的mRNA結構的解旋，這對于mRNA與核糖體結合進而翻譯產生蛋白質非常重要。

RNA解旋酶被認為具有展開雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsDNA）的能力，或通過ATP水解釋放能量來修飾RNA-RNA之間的相互作用[8-9]。DDX家族蛋白表現出典型的SF2的特征。在SF2中，與解旋功能相關的核心氨基酸殘基構成共價連接的球狀結構域，分別命名為區域1（domino 1，D1）和區域2（domino 2，D2），表現為 RecA-ATP 酶折疊。D1位于N端，包含基序Q、基序Ⅰ、基序Ⅰa、基序Ⅰb、基序Ⅱ和基序Ⅲ。D2位于C端，包含基序Ⅳ、基序Ⅴ、基序Ⅵ。基序Ⅰ和基序Ⅱ能與三磷酸腺苷（nucleoside triphosphate，NTP）和鎂離子結合，調節NTP水解的功能。在這兩基序中間的基序Ia和基序Ib則能調節核酸的結合。基序Ⅲ與NTP的水解活動相關。基序Ⅳ、和基序Ⅴ與RNA的結合相關。基序Ⅵ則涉及了與NTP水解有關的構象變化[3]。

有臨床試驗通過免疫組織化學研究發現，28例直腸癌患者中，54%的患者表現出DDX解旋酶過度表達。DEAD box蛋白MrDb是c-Myc基因的一個靶蛋白，可以顯著地促進細胞增殖。研究證實，RCK/p54參與了癌基因如c-Myc、E1A或其他生長相關基因的mRNA翻譯，這可能是因為RCK/p54本身與癌基因c-Myc、E1A或其他生長相關基因等相關聯[10]。MicroRNA（miRNA）在蛋白質合成的過程中起到關鍵作用，在miRNAs誘導的的沉默復合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC） 的影響下，miRNA可靶向mRNA的翻譯，加快mRNA的凋亡。mRNA的降解起始于脫腺苷酶復合物CCR4-NOT縮短多聚A尾，隨后5’帽結構被移除，mRNA被核酸外切而降解。CCR4-NOT的組分CNOT1與DDX6可直接結合。如果打斷DDX-CNOT1之間的結合，可損傷miRISC介導的人類基因沉默[11]。在結腸癌中，miR NA124能直接靶向DDX6，抑制DDX6的翻譯，誘導結腸癌細胞的凋亡[12]。DDX家族蛋白eIF4A存在于真核細胞轉錄起始因子4F（eukaryotic translationinitiation factor 4F，eIF4F）復合體中，能聯合p220和帽結合蛋白eIF4E在翻譯起始中發揮重要作用。因此，DDX6能夠促進基因細胞mRNA的翻譯、增殖和惡性轉移。另外，miR-143和miR-145作為腫瘤抑制因子，被宿主基因NCR143/145調控，DDX6可以通過下調NCR143/145的表達來促進胃癌的進展，在人胃癌樣本中，DDX6表達量遠高于正常胃組織[13]。但對于其功能域具體怎樣發揮作用尚不清楚。

在本研究中，我們利用引物引入突變，截去DDX6的D2區域，使其失去ATP酶和解旋酶活性，將該突變體命名為DDX6-△C，或使DEAD區域上的堿基發生點突變，使其由編碼谷氨酸變為編碼谷氨酰胺，失去解旋酶活性，將該突變體命名為DDX6-EQ并用Western Blot檢測其蛋白表達水平，這為進一步研究DDX6在癌癥進展過程中的作用提供實驗基礎。

圖1 突變體模式圖

圖 2DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 雙酶切鑒定

圖 3DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 序列比較

圖 4 DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C Western Blot鑒定