金連菊復方制劑對大鼠的亞慢性毒性試驗

蘭宗寶,俸祥仁,張 鑫,何莫斌,陳德元,羅 麗,陳 燕

(1.廣西農業科學院 農業科技信息研究所,廣西 南寧 530007;2.廣西南寧強微農牧科技有限公司,廣西 南寧 530001;3.廣西百朋種畜場,廣西 柳州 541502)

隨著我國養豬產業的不斷發展,養豬場規模不斷擴大,豬病也日趨復雜,致使豬場亂用、濫用化學抗生素的現象頻繁發生,不僅容易誘發病原菌的耐藥性及造成生態環境污染,還會導致豬肉藥物殘留,嚴重影響我國食品安全及危害人體健康[1]。為此,國家層面先后制訂發布了《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》、《藥物飼料添加劑使用規范》、《動物性食品中獸藥最高殘留限量》等法規制度,以期進一步規范抗生素在養豬行業中的使用準則。中藥具有天然的保健及藥用成分,可提高機體的免疫力,同時具有抗病毒及抗應激等活性作用[2,3],且毒副作用小,不易誘發病原菌產生耐藥性,目前在畜禽養殖業中已得到廣泛應用[4]。中藥復方制劑是由兩種或兩種以上的中藥材組方而成,其有效成分復雜且多不明確,因此需通過毒理學試驗檢驗組方藥物間的配伍效果,以減少或避免藥物在臨床應用時產生拮抗作用等不良反應[5]。本課題組前期研究發現,金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子等中藥對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等6種豬場常見病原菌均表現為高度敏感,對應的最小抑菌濃度(MIC)較低[6],在此基礎上研發出了金連菊復方制劑(金銀花15 g,連翹25 g,野菊花25 g,烏梅15 g,五倍子20 g)。根據新獸藥臨床前研究階段要求,需采用實驗動物開展相關安全性試驗以考察產品開發的可行性及驗證藥物的安全性。因此,我們以Wistar大鼠為動物模型開展了金連菊復方制劑的亞慢性毒性試驗,旨在評價其用藥安全性,為金連菊復方制劑的獸醫臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金連菊復方制劑的中藥原材料(金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子)購自廣西玉林市中藥材專業市場。Wistar大鼠(雌、雄各半)購自廣西醫科大學實驗動物中心,共100只,體重80～120 g/只。在試驗期間飼喂大鼠全價飼料,室溫控制在18～22 ℃,相對濕度為40.0%～70.0%。本試驗所用的主要儀器設備有體視顯微鏡、手提式壓力蒸汽消毒器、生化無菌培養箱、血細胞分析儀、生化分析儀和尿液分析儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 中藥材處理 按組方配比精確稱取烏梅、連翹、五倍子和野菊花總量500.0 g,在煎煮前以5～7倍蒸餾水浸泡1～2 h,煎煮30 min后收集藥液；再加入3～5倍蒸餾水，繼續煎煮30 min；合并兩次藥液，濃縮至生藥含量為1.0 g/mL；以4000 r/min離心20 min,收集上清液裝瓶備用。用95%乙醇浸泡金銀花6～8 h,收集浸提液；藥渣再用95%乙醇浸泡4～6 h；合并兩次浸提液，在80 ℃下加熱回流1.5～2.0 h,收集浸提液,過濾,濃縮至生藥含量1.0 g/mL,裝瓶備用。按85∶15的比例合并上述兩種藥液,以手提式壓力蒸汽消毒器滅菌30 min,即獲得金連菊復方制劑。在試驗前濃縮或稀釋至設計的用藥濃度。

1.2.2 試驗分組及給藥 對Wistar大鼠先進行適應性飼養1周,然后隨機分5組,每組20只,雌、雄各半。其中4組為給藥劑量組(Ⅰ～Ⅳ組),分別經口灌服不同濃度(0.5、1.0、2.0和5.0 g/mL)的金連菊復方制劑,每只Wistar大鼠每天灌服一次,按每100 g體重灌服1.5 mL的劑量給藥;對照組(CK)灌服蒸餾水。連續給藥90 d,在試驗期間每日觀察并記錄大鼠的活動、進食及飲水情況,每周稱重一次。

1.2.3 測定指標及方法 停藥后第2天對所有Wistar大鼠進行眼球采血,將每只Wistar大鼠的血樣分成2份:一份以抗凝劑抗凝,用于血常規指標檢測;另一份靜置析出血清,用于檢測血清生化指標。完成采血工作后,每組隨機選取10只Wistar大鼠進行剖檢,稱取心臟、肝臟、脾臟、甲狀腺、腎臟等主要器官的重量,計算各器官的臟器系數;同時采集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、腸道等器官組織進行固定和制作石蠟切片,用于組織病理學檢測。

1.3 統計分析

對試驗數據采用Excel 2007進行整理,用DPS進行單因素方差分析,并以Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 金連菊復方制劑對Wistar大鼠體重增長的影響

在整個試驗周期內,各給藥劑量組Wistar大鼠未見死亡和明顯的中毒癥狀,生長活動基本正常。由表1可知：在試驗0～8周期間各給藥劑量組Wistar大鼠的體重增長幅度與CK無顯著差異,且均表現為雄性Wistar大鼠的體重增長幅度大于雌性Wistar大鼠。從第9周開始,Ⅳ組雄性Wistar大鼠的體重增長幅度明顯降低,其中,第9周的增重與CK相比差異顯著(P<0.05),第10～13周的增重與CK相比差異極顯著(P<0.01);Ⅳ組雌性Wistar大鼠從第10周開始其體重增長幅度也明顯降低,與CK相比差異極顯著;而Ⅲ組雄性Wistar大鼠的體重增長幅度從第11周起顯著低于CK。

2.2 金連菊復方制劑對Wistar大鼠臟器系數的影響

試驗結束時剖檢發現：Ⅳ組Wistar大鼠的心臟、甲狀腺和腎臟增大,其中,心臟系數與CK相比呈顯著增加趨勢,甲狀腺和腎臟的臟器系數與CK相比差異極顯著;而Ⅰ～Ⅲ組Wistar大鼠心臟、肝臟、脾臟、甲狀腺和腎臟的臟器系數與CK相比差異均不顯著(表2)。

2.3 金連菊復方制劑對Wistar大鼠血常規指標的影響

由表3可知：Ⅲ組Wistar大鼠的血小板數較CK顯著下降，但其紅細胞壓積較CK極顯著上升；Ⅳ組Wistar大鼠的血小板數及血小板壓積均較CK極顯著下降,但其指標值均在正常范圍內;Ⅰ～Ⅱ組Wistar大鼠的各項血常規指標與CK間差異均不顯著。說明金連菊復方制劑對Wistar大鼠的血常規指標基本上無明顯影響。

表1 金連菊復方制劑對Wistar大鼠體重增長的影響 g/只

注:“*”或“**”分別表示與CK相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。表2～表4與此相同。

表2 金連菊復方制劑對Wistar大鼠臟器系數的影響

表3 金連菊復方制劑對Wistar大鼠血常規指標的影響

2.4 金連菊復方制劑對Wistar大鼠血清生化指標的影響

由表4可知：Ⅳ組Wistar大鼠的血糖含量和堿性磷酸酶活性顯著低于CK,而其尿素氮和肌酐含量極顯著高于CK;Ⅰ～Ⅲ組Wistar大鼠的各項血清生化指標與CK間差異均不顯著。說明0.5～2.0 g/mL的金連菊復方制劑對Wistar大鼠的血清生化指標無明顯影響。

表4 金連菊復方制劑對Wistar大鼠血清生化指標的影響

2.5 組織病理學檢查結果

在亞慢性毒性試驗結束后剖檢觀察,發現不同處理組Wistar大鼠的器官組織均未見任何異常和可疑病理變化。采集CK和Ⅳ組Wistar大鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、腸道等器官組織制作石蠟切片,僅發現Ⅳ組Wistar大鼠的腎臟略有變化,其腎小囊間隙增大,但其他器官組織均未觀察到異常病理變化(圖1)。上述結果表明金連菊復方制劑對Wistar大鼠臟器組織無損害作用。

圖1 CK和Ⅳ組Wistar大鼠的臟器組織石蠟切片觀察結果

3 討論

中藥復方是中醫用藥的主要形式,是基于辯證的思想觀點,按照“君—臣—佐—使”的組方原則,選擇恰當的藥物定量配伍而成[7]。與單方藥物相比,復方制劑具有改善服用藥品依從性、提高藥物療效、減少不良反應、降低用藥費用等優點[5],目前在畜禽養殖生產上已得到廣泛應用。丁俊仁等[8]針對新生仔豬腹瀉病,以黨參、金銀花、干姜、半夏、藿香、甘草、茯苓等研制出參金口服液;吳苑瀅等[9]以魚腥草、桔梗、陳皮、茯苓等為原料研發出魚腥草桔苓合劑,并證實該合劑對Wistar大鼠無慢性毒性作用,安全性好;肖蕊等[10]在桂柴方劑的基礎上研發出針對雞風寒感冒的桂柴感寒口服液;鄧鑫等[5]以廣西地道藥材苦玄參和桃金娘根為主要藥味，制備獲得了復方苦玄參顆粒,該顆粒具有清熱瀉火、消炎止痢的功效。本研究中的金連菊復方制劑是依據金銀花、連翹、野菊花、烏梅和五倍子等5味中藥對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等6種豬場常見病原菌高度敏感而研發獲得的,以期作為飼料添加劑應用于斷奶仔豬的育肥養殖。

中藥復方制劑是否安全是進一步研究其藥理、毒理作用的基本保障,同時對評價新藥是否具備研發價值具有重要意義,即開展急性毒性試驗和亞慢性毒性試驗是評價中藥復方制劑安全性的必要環節[11]。其中,亞慢性毒性試驗是通過不同劑量的長期重復給藥,觀察不同劑量藥物長期在動物體內可能發生的不良反應,從而判斷藥物對靶器官和受試動物的累積作用,并明確安全的可重復給藥劑量值區間,為臨床科學用藥提供理論依據[12]。本研究以金連菊復方制劑連續灌服Wistar大鼠90 d,是常規亞慢性毒性試驗周期(30 d)的3倍,以期更好地揭示該藥物的亞慢性毒性作用。結果表明,各劑量組Wistar大鼠除個別檢測指標較CK呈顯著或極顯著升高或降低變化外,整體上其體重增長速率、臟器系數、血常規指標、血清生化指標及主要臟器組織結構與CK相比無明顯變化,說明長期服用金連菊復方制劑對Wistar大鼠無亞慢性毒性作用,安全性好。但金連菊復方制劑作為飼料添加劑應用于斷奶仔豬育肥養殖的給藥劑量尚需進一步研究確認。