刺老苞根皮水煎劑對去勢小鼠的血清雌二醇、骨堿性磷酸酶及骨鈣素的影響及意義

王松月 薛帆 宋晶珠 李金誠 裴凌鵬

100081民族醫藥教育部重點實驗室，中央民族大學藥學院，北京

刺老苞又名楤木，為五加科，屬頭序楤木、棘莖楤木、短序楤木，以及食用楤木，為土家族用來祛風除濕，強筋健骨的常用藥[1]。刺老苞始載于《千金方》，治療腸癰，其他古代醫書對其也有相關記載，《本草推陳》中記載：“楤木樹皮及根皮均有健胃、收斂、利尿及降糖作用。”《滇南本草》中記載：“刺腦包，又名刺老包、鵲不踏。味苦辛、性涼，入脾、腎二經。治風濕痛、胃痛、跌打損傷。”本實驗室前期的藥理作用研究表明，刺老包根皮可以改善大鼠骨質量，減少骨髓腔的脂肪含量，抑制大鼠骨丟失。本研究的目的是通過去勢后小鼠模型，評估刺老苞根皮對于去勢后小鼠骨代謝血清學的影響及其意義。

資料與方法

實驗動物：選取健康SPF 級12 周齡C57雌性小鼠80只，體重(21.62±0.76)g，購買于斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物合格證編號[SCXK(京)2014-0010]。實驗前，所有小鼠均于北京海淀區衛計委實驗動物中心內飼養，室溫維持于16～22 ℃，濕度60%～75%，明暗交替照射12 h/12 h，不限制水及食物的攝入，應用常規鼠糧進行喂養。

實驗分組：第15 周去勢手術完成后，選取符合選入標準(陰道涂片無明顯動情周期)小鼠，按照體重隨機分為5組，每組10只，分別為模型組(OVX，n=10)、空白對照組(Control group，CG，n=10)、刺老苞根皮水提取物組(CLB，n=10)、仙靈骨葆組(XL，n=10)、阿侖膦酸鈉組(AST，n=10)。

實驗藥物：①刺老苞根皮水煎劑的制備：將干燥的刺老苞根皮生藥243.36 g加入10 倍蒸餾水于圓底燒瓶中，沸騰之后，于120 ℃加熱60 min，待冷卻后倒出水煎劑，再加入6 倍蒸餾水，沸騰后，于120 ℃加熱30 min，冷卻后合并兩次煎液，在常壓下進行濃縮，濃縮至每100 mL 水煎劑含生藥79.7 g。②阿侖膦酸鈉：化學名1,1-二甲基-2-甲硫基乙胺，生產于杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20130085。③仙靈骨葆膠囊：主要成分為淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃；生產于國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司；國藥準字Z20025337。

實驗主要試劑：0.3%戊巴比妥鈉(10 mL/kg，中國中醫科學研究院饋贈)、10 萬U 青霉素注射液(北京鼎國生物技術有限責任公司)、75%酒精(國藥集團化學試劑有限公司)、0.9%氯化鈉溶液(天津市贏達稀貴化學試劑廠)、4%多聚甲醛(武漢賽維爾生物科技有限公司)、雌二醇試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法，武漢優爾生商貿有限公司)、骨堿性磷酸酶試劑盒(酶聯免疫吸附實驗法，武漢華美生物工程有限公司)、骨鈣素檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法，武漢優爾生商貿有限公司)。

實驗主要儀器：手術剪(蘇州六六視覺科技股份有限公司)、手術彎鉤鑷(上海醫療器械有限公司手術器械廠)、手術縫合針(上海小昱醫療器械有限公司)、手術縫合線(揚州金環醫療器械廠)、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、酶標儀(FlexStation3，美國分子儀器公司)、-20℃冰箱(海信公司)、全自動生化儀(日立7020)、載玻片(江蘇世泰器材有限公司)、電子天平(YP601N，上海菁海儀器有限公司)、旋轉蒸發儀(RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠)、離心機(D1008，大龍興創實驗儀器有限公司)、 水浴鍋(TL-420D，姜堰市天力醫藥器械廠有限公司)、10 μL移液器(KE0012951，大龍興創實驗儀器有限公司)。

實驗方法：①去勢骨質疏松小鼠模型的制作：空白對照組僅從兩側卵巢旁邊切除少許脂肪組織，不做卵巢摘除，其他4 組均進行雙側卵巢切除手術。首先用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，待小鼠無自主神經反射時，將小鼠進行固定，手術時于腹部剃毛，形成約3 cm×5 cm 的去毛區，以75%酒精消毒后。其后于肋下1 cm 沿腹中線向下做縱向切口，長約1～2 cm，切開皮膚、筋膜后，鈍性分離肌肉，在腸系膜脂肪中找到呈粉紅色的卵巢及緊密相連的子宮角，結扎并切斷子宮角，將卵巢摘除，縫合腹部肌肉及皮膚。常規飼養，術后1 周給予10 萬U 青霉素腹腔注射治療，與此同時采集小鼠陰道涂片，并于顯微鏡下觀察小鼠動情周期是否完整，若未見完整動情周期出現，即將小鼠納入下一步實驗。②小鼠的給藥方法：去勢小鼠刺老苞根皮水煎劑組每天灌服刺老苞根皮水煎劑1.23 g/(kg·d)，去勢小鼠仙靈骨葆組每天灌服仙靈骨葆混懸液0.18 g/(kg·d)，去勢小鼠阿侖膦酸鈉組每天灌服阿侖膦酸鈉溶液1.22 mg/(kg·d)，去勢小鼠模型組及假手術空白對照組每天灌服等體積蒸餾水，共給藥12 周，給藥量隨小鼠每周體重變化而從新計算得出。③小鼠標本采集及測定方法：經灌胃12 周后，進行取血處理，通過摘眼球取血法，將取出的全血于室溫下靜置2 h，離心，分離出血清，保存在-20 ℃的冰箱中。④血清堿性磷酸酶(ALP)含量測定方法：血清骨鈣素應用酶聯免疫吸附試法測定，按照試劑盒說明書進行操作。⑤血清骨鈣素(DC)含量測定方法：血清骨鈣素應用酶聯免疫吸附試法測定，按照試劑盒說明書進行操作。⑥血清雌二醇(E2)含量測定方法：血清骨鈣素應用酶聯免疫吸附試法測定，按照試劑盒說明書進行操作。

表1 刺老苞根皮水煎劑對血清E2、BALP和BGP水平的影響±s)

表1 刺老苞根皮水煎劑對血清E2、BALP和BGP水平的影響±s)

注：與去勢組相比，?P＜0.05；與空白對照組相比，??P＜0.05。

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結 果

血清E2水平：與去勢模型組相比，空白對照組E2含量(137.15±80.53)pg/mL,組間差異有統計學意義(P＜0.05)pg/mL；仙靈骨葆組E2含量(122.38±52.21)pg/mL，相較于空白對照組及模型組差異無統計學意義；刺老苞根皮水煎劑組E2含量(97.84±11.58)pg/mL，相較于空白對照組及模型組差異無統計學意義；阿侖膦酸鈉組E2含量(137.15±80.53)pg/mL，相較于空白對照組差異有統計學意義。

血清骨堿性磷酸酶(BALP)水平：與去勢模型組相比，空白對照組BALP 含量(4 155.87±397.16)ng/mL 組間差異有統計學意義(P＜0.05)；阿侖膦酸鈉組BALP 含量(3 904.86±300.21)ng/mL，相較于空白對照組及模型組差異無統計學意義；仙靈骨葆組BALP 含量(3 793.77±533.24)ng/mL，相較于模型組差異無統計學意義；刺老苞根皮水煎劑組BALP 含量(3 511.14±978.46)ng/mL，相較于模型組差異有統計學意義。

血清骨鈣素(BGP)水平：空白對照組BGP 含量(3.45±0.36)ng/mL，阿侖膦酸鈉BGP 含量(3.43±0.32)ng/mL，仙靈骨葆BGP 含量(3.44±0.28)ng/mL，刺老苞BGP含量(3.21±0.35)ng/mL，與去勢模型組相比差異無統計學意義。見表1。

討 論

本實驗選取了阿侖膦酸鈉及仙靈骨葆作為小鼠的陽性藥對照組，阿侖膦酸鈉作為雙膦酸鹽類藥物對于骨質疏松的預防有準確的療效，可以有效減少骨吸收抑制骨破壞[2]。而仙靈骨葆在中醫學理論的指導下，主要以補肝腎、強筋骨的理論來調節骨代謝，增高骨密度[3]，這與刺老苞根皮的功效有著相似之處，刺老苞根皮也具有強筋健骨的功效[4]，故選用這兩種藥來驗證刺老苞根皮對于骨代謝的影響。

E2作為雌激素的存在形式，其含量可以反映雌激素的水平，去卵巢后雌激素的分泌明顯下降，雌激素具有促進成骨細胞的增殖和誘導破骨細胞凋亡的作用，雌激素一旦降低則會引起骨代謝平衡失調，從而引發骨量流失，產生骨質疏松[5]。本研究發現，空白對照組的E2含量明顯高于去勢力組的E2含量，說明去勢小鼠模型的去勢手術是成功的，并且可能出現骨形成減少以及骨吸收增加的現象。

BALP 是骨形成的特異性指標，并且可以反映出骨重建的活躍性。臨床的研究中也表明，BALP 可以作為骨代謝疾病的重要依據[6]。本實驗中去勢組的BALP含量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，并且也明顯高于仙靈骨葆組及刺老苞根皮水煎劑組(P＜0.05)，說明了去勢組小鼠體內可能存在部分成骨細胞破壞的現象，而刺老苞根皮水煎劑組，仙靈骨葆組對于去勢組小鼠有顯著的治療作用。血清中BGP 的變化，不僅反映了成骨細胞的活性，還是骨質礦化的特殊標志物[7]，本實驗中各組小鼠的BGP 水平與模型組相比，均未有顯著性差異，說明各組小鼠骨礦化速率無明顯差異。

綜上而言，刺老苞根皮水煎劑能夠有效降低去勢小鼠BALP 含量，但對于E2和BGP 水平影響不大，說明刺老苞根皮水煎劑可能通過增強成骨細胞活性改善去勢小鼠體內骨代謝失衡的狀態，對于小鼠的骨形態的影響有待本實驗室的后續檢測。