丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的相互作用

陳鳳英，楊林，黎祥妨

（商洛學院化學工程與現代材料學院/陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室，陜西商洛726000）

血清蛋白與藥物小分子之間的相互作用，是生物化學領域的重要研究內容之一。血清白蛋白是生物體血漿中含量最豐富的運輸蛋白質，能夠與類別廣泛的內源和外源性物質結合，將藥物分子輸送到人體各個部位。小分子藥物被生物體吸收后，與血漿蛋白可逆性結合后進入血液循環系統，并且小分子藥物與血漿蛋白的可逆性結合能夠影響其在生物體內的分布、生物活性和毒性。因此，從光譜學角度研究小分子與蛋白質相互作用的過程和機理，對于深入研究小分子藥物在生物體內的運輸、分布以及在人體的代謝過程具有十分重要的意義[1-3]。丹參酮ⅡA是中藥丹參中的活性成分之一，難溶于水，口服吸收效果較差。丹參酮ⅡA-磺酸鈉是由丹參酮ⅡA經過磺化而成的鹽[4]，具有縮小心肌梗死面積、改善胃黏膜血液供應、抑制中樞神經系統降低血液粘度、抑制血小板集聚及抗血栓形成等作用，臨床上主要用于心絞痛、冠心病、急性腦出血等病癥的治療[5]。目前，對丹參酮ⅡA-磺酸鈉的研究主要集中在藥效、藥理以及含量測定等方面[6-8]，與蛋白質的作用機理方面的研究未見報道。本文在模擬生理條件下，采用紫外光譜和熒光光譜兩種方法研究了丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的相互作用機理，計算了不同溫度下二者的結合常數以及反應過程的ΔG、ΔH、ΔS等熱力學參數，推測了二者之間結合力的類型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

丹參酮ⅡA-磺酸鈉和牛血清蛋白為生化試劑，三（羥甲基）胺基甲烷、濃鹽酸和氯化鈉均為分析純，使用前未做任何處理。

pH精密酸度計（上海大普儀器有限公司），熒光光譜儀（日本日立高新技術公司），紫外可見光譜儀（上海恒勤儀器有限公司），超聲波振蕩儀（重慶市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫外光譜法

在編號為1～10的10 mL的容量瓶中加入2×10-5mol·L-1的牛血清蛋白溶液1.0 mL，然后再依次加入體積分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的丹參酮ⅡA-磺酸鈉溶液，用pH=7.40的0.1 mol·L－1的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL，搖勻，分別在285.8、298、310 K溫度下充分反應30 min。以Tris-HCl溶液為參比溶液，測量各溶液的紫外可見吸收光譜。

1.2.2 熒光光譜法

測試溶液的配制方法同1.2.1，固定熒光激發波長為280 nm，波長300～500 nm掃描的熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜法

285.8 、298、310 K時丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的紫外可見光譜見圖1。由圖1可以看出，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的吸收峰峰形基本不變，隨著丹參酮ⅡA-磺酸鈉濃度的增加同一波長處的吸光度在不斷增大。

圖1 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的紫外吸收光譜

由圖2可得，在285.8 K時，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的線性方程為y=5.9093×10-6x－1.677，R=0.9924；在298 K時，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的線性方程為y=4.5709×10-6x－0.7981，R=0.9971；在310 K時，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的線性方程為y=3.6550×10-6x+0.6271，R=0.9942，通過計算，在285.8、298、310 K時的結合常數分別為2.18×105、1.75×105、1.35×105L·mol-1，表明牛血清蛋白與丹參酮ⅡA-磺酸鈉的結合常數隨著溫度的升高而降低。

圖2 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與BSA結合的Lineweaver-Burk雙倒數

2.2 熒光光譜法

2.2.1 丹參酮ⅡA-磺酸鈉對牛血清蛋白的熒光猝滅

牛血清蛋白的內源熒光來自分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等殘基，熒光體在某些物質的作用下會發生熒光猝滅，許多藥物或有機小分子化合物都是熒光猝滅劑。在285.8、298、310 K時牛血清蛋白與丹參酮ⅡA-磺酸鈉的熒光光譜的變化情況見圖3，隨著丹參酮ⅡA-磺酸鈉濃度的增加，牛血清蛋白的內源熒光強度降低，但它的峰位及峰形基本不變，表明丹參酮ⅡA-磺酸鈉對牛血清蛋白的熒光有猝滅作用。

2.2.2 熒光猝滅的類型

熒光分子與其它分子相互作用引起熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅，可分為：動態猝滅和靜態猝滅。靜態猝滅是由于猝滅劑與熒光物質相互作用而生成了一定構型化合物，導致熒光物質熒光強度減弱的現象，靜態猝滅過程符合Lineweaver-Bruk雙倒數方程[9]：

式中:KLB為猝滅劑與小分子藥物的結合常數，F0為無丹參酮ⅡA-磺酸鈉時的熒光強度，F為加入一定濃度的丹參酮ⅡA-磺酸鈉后的熒光強度，[Q]為小分子藥物的濃度。在298 K和310 K時丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白相互作用的Lineweaver-Bruk雙倒數曲線如圖4所示。根據圖4可以得到，在285.8、298、310 K時，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結合常數分別為1.71×105、1.69×105、1.22×105L·mol-1，結合常數隨溫度的升高而減小，說明丹參酮ⅡA-磺酸鈉對牛血清蛋白的熒光猝滅屬于靜態猝滅。

圖3 丹參酮ⅡA-磺酸鈉對牛血清蛋白的熒光猝滅光譜

2.2.3 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白結合作用力

藥物小分子與白蛋白大分子之間的作用力主要表現為：氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水作用力等。研究表明，若反應的焓變△H>0，熵變△S>0時，分子之間的相互作用力為疏水作用力；若反應的焓變△H<0，熵變△S>0時，分子之間的作用力為靜電引力；若△H<0，△S<0，分子之間的相互作用力為氫鍵和范德華力[10]。丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白結合過程的熱力學參數見表1。由表1可見，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白相互作用的△H<0，△S>0，因此，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白之間的作用力主要為靜電引力。

表1 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白相互作用的熱力學參數

圖4 丹參酮ⅡA-磺酸鈉對BSA熒光猝滅的Lineweaver-Bruk

2.2.4 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結合位點數

靜態猝滅過程的藥物小分子和血清蛋白的結合位點數，可根據lg[(F0-F)/F]=lg K+n lg[Q]求算。其中，F0為未加入藥物小分子時牛血清蛋白的熒光強度；F為加入猝滅劑藥物小分子濃度為[Q]時的熒光強度。

圖5是298 K和310 K時lg[(F0-F)/F]～l g[Q]曲線，通過線性擬合得到丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結合位點數n分別為0.93、0.94和0.98，說明丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白只有1個結合位點數。

圖5 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結合常數

3 結論

采用紫外光譜和熒光光譜兩種方法研究了丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的相互作用，當反應溫度為285.8、298、310 K時，紫外光譜法研究得到二者的結合常數分別為2.18×105、1.75×105、1.35×105L·mol-1，結合常數隨溫度的升高而降低。在反應溫度為285.8、298、310 K時，熒光光譜法研究得到二者的結合常數分別為1.71×105、1.69×105、1.22×105L·mol-1，與紫外光譜法得到結果一致。丹參酮ⅡA-磺酸鈉對牛血清蛋白的熒光猝滅方式屬于靜態猝滅，二者的結合位點數為1，主要通過靜電引力作用結合。