熒光顯微鏡校準技術的現狀分析

王 菲,張 玲,俞曉平,葉子弘

(1.中國計量大學 生命科學學院, 浙江 杭州 310018;2.中國計量科學研究院,北京 100013)

熒光顯微鏡利用紫外光或者藍紫色光激發樣本產生熒光,在黑暗的環境下觀察和分辨樣品中的某些物質及其性質[1]。市面上的熒光顯微鏡主要以落射式熒光顯微鏡為主,根據落射式熒光顯微鏡的工作方式又可以分為正置熒光顯微鏡和倒置熒光顯微鏡。圖1展示的是正置熒光顯微鏡的光路示意圖。以GFP通道為例,激發濾光片(1):僅讓波長為450～490 nm的藍紫色光通過;二向分色鏡(2):將低于510 nm的光反射在樣本上,并將高于510 nm的光透射過去;反射濾光片(3):去除不需要的熒光信號,通過520～560 nm的特殊綠色熒光,這樣就實現了對較強的短波長激發光源的屏蔽,而僅允許通過更長波長的熒光,使得目鏡系統僅獲得熒光信號,而不受到其他光線的干擾。隨著社會經濟的發展需要,熒光顯微鏡現已應用在各領域,例如用于檢測表征高分子形態、表面和界面[2];測試水中油濃度[3],分析巖芯圖像[4],觀察水生動物病毒[5],檢測瀝青質量[6],檢驗印文與字跡先后順序[7],觀察纖維切片[8]等。

圖1 熒光顯微鏡的工作原理Figure 1 Working principle of fluorescence microscope

為確保熒光分析數據的準確性和可靠性,熒光顯微鏡校準技術應運而生,特別是在生物醫學方面,校準技術的提高有利于分析病毒和細胞,提出解決方案。在藥物分析與篩選中,不同藥物對細胞形態和細胞熒光產生的影響;腫瘤組織發生發展、腫瘤細胞分化浸潤等過程中,細胞形態和細胞熒光產生的變化;都需要熒光顯微鏡檢測結果可以定量分析和比較。

本文介紹的是熒光顯微鏡校準技術的兩個部分,一個是熒光顯微鏡的顯微校準技術,主要是為了提高熒光成像的分辨率以及清晰度;另一個是熒光校準技術,主要是從熒光的角度分析提高顯微鏡之間的數據的可比性。

1 熒光顯微鏡顯微技術的校準

熒光顯微鏡在觀察熒光物質時,會通過CCD照相機檢測熒光成像,然后根據熒光成像來分析熒光物質的性質,所處的位置以及熒光物質的數量,所以一臺熒光顯微鏡能否達到實驗的要求主要是看生成的熒光成像是否具有高分辨率和高清晰度。但近百年來,光學顯微鏡一直飽受“阿貝極限”的困擾,即光學顯微鏡的分辨率不能超過光波波長的一半,為了可以更進一步的觀察,科研人員根據熒光顯微鏡的光源、濾色系統、光學系統以及成像系統提出改進措施或者是新的算法。

市面上應用的熒光顯微鏡光源一般都是汞燈或者超高壓汞燈[9],在不替換光源的前提下,袁志偉[10]設計了一種用汞燈作為活化光源的三維超高分辨熒光顯微鏡的新型實驗方法,該方法實現了亮暗狀態的快速轉換,減少成像所需時間,達到了40 nm的橫向分辨率和100 nm的軸向分辨率的超高分辨熒光顯微鏡,并驗證了其在細胞成像上的可行性。近年來,隨著LED技術的發展,一些大型重點實驗室也會選擇使用LED燈來提高顯微鏡觀察的分辨率同時用來校準熒光顯微鏡的視場清晰度[11],但是造價比較昂貴并沒有得到普及。當然不同的實驗要求需要使用不同的熒光光源,例如在追求紫外光激發效能的連續穩定性可以采取帶狀光譜特征的氙燈光源(細胞Ca2+測定)[12]。確定了發光源,接著可以通過減小孔徑光闌提高光譜純度降低單色光的能量[13],以提高光源光學系統的工作效率。

熒光顯微鏡顯微校準技術最關鍵的部分還是校準熒光顯微鏡的成像系統,文橋等[14]提出一種用于熒光顯微鏡的正交偏振濾波圖像增強技術,能夠顯著提高成像質量,豐富了從強激發光中提取弱熒光信號技術手段,且不受激發光與熒光波長的限制;任利強[15]提出了新的景深計算方法并確定了適用于熒光顯微鏡的自動對焦方法,實現了多層熒光圖層融合,大幅度提高圖像的信息量和對比度。這兩種顯微校準方法主要是針對免疫熒光提出的,該技術己廣泛應用于病毒學、免疫病理學、寄生蟲學、細菌學和腫瘤學等多個生物學和醫學領域中。李云章等[16]設計了基于數字微鏡器件(DMD)的熒光顯微鏡探測系統,不僅能對樣品實現熒光成像,而且還能探測不同區域樣品激發熒光信號能量的實時變化;常敏,劉天成[17]通過對顯微采集原始圖像進行灰度變換、直方圖均衡化等處理方法從而快速準確地獲取目標的圖像特征,提高細胞定位精確度。這兩種校準方法旨在獲取熒光信號,特別是微小的不易觀察的熒光信號,從而獲取熒光成像對其進行熒光分析。曹國威等[18]利用熒光蛋白激活狀態的可逆特性,提出一種提高熒光顯微鏡縱向分辨率的方法,針對不同數值孔徑的顯微系統,通過合理選擇帶渦旋相位的軸對稱偏振光作為激活光和退活光,并設計衍射光學元件對其進行調制,從而實現百納米級的縱向選擇激活;鹿偉民[19]基于LED光源和可編程數字微鏡陣列(DMD),設計和搭建了結構光照明超分辨率熒光顯微鏡,利用設計的結構光生成模塊與奧林巴斯X73顯微鏡結合做成了SIM超分辨成像系統,并設計了SIM超分辨率重構算法。這兩種校準方法都是為了突破“阿貝極限”而提出的新的算法,是一種簡單可行的超分辨率成像方法。

近年來,隨著計算機技術和工具的不斷進步,學科的交叉和聯系越來越緊密,熒光顯微鏡的成像技術大大提高[20],2014年美國科學家埃里克·貝齊格、威廉·莫納和德國科學家斯特凡·黑爾,這三位科學家研究發明受激發射損耗(STED)熒光顯微術和單分子熒光顯微成像技術,從而突破了“阿貝極限”,將光學顯微鏡步入了納米時代[21],可以說熒光顯微鏡的顯微校準技術達到了一個新的頂峰。

2 熒光顯微鏡的熒光校準

熒光顯微鏡顯微技術的校準主要是針對單個熒光顯微鏡的,為了讓實驗室之間以及儀器之間的熒光數據、熒光強度能夠進行對比分析,還需要對熒光顯微鏡進行熒光校準,也對熒光顯微鏡的日常校準、穩定性、準確性評價提出新的要求。這些發展需要重新評估有效的儀器校準和鑒定程序,美國標準技術研究院(NIST),德國聯邦材料研究檢測院(BAM),法國的Argo light公司以及一些科研人員相繼開發出比較實用的熒光顯微鏡校準玻片和新的校準方法。

美國NIST[22]開發的的校準玻片是在1 mm厚玻璃載片上涂層熒光薄膜,涂層厚度小于10 μm,532 nm和633 nm激發時,在250 μm2的區域內具有99%或更高的平均強度均勻性,并提供經認證的校正發射光譜。也就是說可以使用相同的校準對來校準兩個不同的激發波長或者是根據波長的特征用標準對進行校準。微陣列材料標準設計如圖2[22]。

圖2 微陣列材料標準設計Figure 2 Design of material standards for microarrays

德國BAM的研究人員Brunner[23-24]提出了一種新校準工具的設計理念,校準玻片由不同定義的二次區域組成,區域內填充綠色和紅色染料摻雜聚合物,根據掃描儀之間的定義參數確定熒光區域的染料摻雜聚合物的濃度范圍并用未摻雜的非熒光聚合物測定背景信號,聚合物層內染料分布具有適當均勻性和足夠的光穩定性。校準玻片如圖3[24]。校準玻片可以有效定期地評估和控制微陣列掃描器生物芯片的性能,最終作為熒光強度標度用于分析結果和提高診斷測試整體的可比性。

圖3 雙色熒光校準玻片Figure 3 Two-color fluorescence calibration slide

法國Argo light[25-26]公司設計出一種用于性能評估和監控的新型校準工具,分為兩個部分,硬件主要就是校準玻片,軟件就是Daybook。校準玻片采用非熒光物質的透明材料進行3D激光光刻,玻片表面的光刻圖形有靶形、格子形、豎條形以及交叉樓梯形,校準玻片如圖4[26]。靶形校準玻片是用來校準成像嵌入位置;格子形和豎條形校準玻片是用來校準成像質量和重建正確性,也可測量橫向分辨率;交叉樓梯形是用來校準共焦顯微鏡的光譜切片。

圖4 Argo light顯微鏡校準玻片Figure 4 Microscope calibration slide from Argo light

Micheal Halter[27]等人使用鈾酰離子摻雜玻璃和肖特475 GG過濾玻璃作為標準材料,設計一種自動化測試基準,通過將檢測閾值、飽和度和線性動態范圍與參考材料進行基準比較來表征熒光成像系統的性能。校準玻片如圖5[27](肖特玻璃A是玻璃-聚合物復合材料,鈾酰離子摻雜玻璃B是NIST標準物質(SRM[28])的改良組合物),其認證值可用于校正測量光譜形狀失真的熒光發射光譜。基準測試程序針對放大率,檢測器的物理像素大小和圖像數據的位深度的差異進行歸一化,以便可以在多種儀器配置上比較分析度量。

圖5 肖特475GG玻璃(A)和摻雜鈾的玻璃(B)粘在顯微鏡玻片上Figure 5 Cut and polished piece of the Schott 475 GG filter glass(A) and the uranyl-ion-doped glass(B) mounted to a microscope slide

顯微鏡校準玻片進行熒光顯微鏡校準時,固定夾片對玻片進行擠壓,校準玻片會有輕微的彎曲,降低熒光顯微鏡校準的準確性。Jean[29-31]設計發明一種校準工具,以不透明的剛平面為支撐板,其上覆蓋一層熒光固體和一層非熒光材料的薄金屬膜,然后將光致抗蝕劑施加到金屬層上,通過限定對準特征的精密掩模暴露工具對表面進行化學蝕刻以形成參考圖案。熒光顯微鏡對準工具平面如圖6[29-31],圖6A[29]熒光校準平面主要用于校準熒光顯微鏡的軸,最終目的是為了量化熒光顯微鏡;圖6B[30]熒光校準平面主要用于校準熒光顯微鏡的光學元件的樣本位置或者校準顯微鏡中的熒光檢測;圖6C[31]熒光校準平面主要用于校準光軸或者處理近似平坦物體的軸的受限視野的物鏡,包括可傾斜聚焦的透鏡。

圖6 熒光顯微鏡對準工具平面圖Figure 6 Plan view of a fluorescent microscopy alignment tool

熒光顯微鏡的校準除了校準玻片的研究,也會有一些新的校準方法,比如SIP(Sectioned Image Property)校準方法以及德國漢諾威醫學院的Malte Butzlaff[32]研究出的新型的校準方法eSIP(extended Sectioned Image Property)。SIP校準方法主要是通過對固體熒光層提取相關的圖像信息,并從中獲取參數進行分析。此方法雖具有為分段成像條件的一般表征提供基礎的潛力,但仍然存在類似于噪聲干擾的弊端,所以Malte Butzlaff提出了eSIP校準方法。eSIP校準方法是將熒光溶液樣本代替SIP校準方法的固體熒光層樣本,并對SIP參數(光學切片強度分布的半最大值FWHM)進行修改,從光子統計中獲得記錄的光子數允許隨時間控制顯微鏡的性能,免受噪聲干擾,還可以比較不同顯微鏡設置的靈敏度。

目前,各國機構對熒光顯微鏡的校準都展開了自己的研究,特別是儀器數據可比性方面。熒光校準需要考慮熒光染料、熒光強度、熒光光譜以及激發波長的差異,現存的校準方法或者校準玻片只是針對熒光顯微鏡的一個或幾個方面,如此還需要對熒光顯微鏡的熒光校準進行更深入的研究。

3 結 論

總的來說,熒光分析為材料科學、環境分析、生物分析、分子遺傳學、細胞生物學、醫學診斷學和藥物篩選作出了巨大的貢獻,而熒光顯微鏡的校準技術就是為了給熒光分析提供保障。本文提出的熒光校準方法可以為以后開展相關的校準工作提供參考。