枝孢霉菌生長規律及對噴氣燃料性質的影響

牛明明，熊 云，許世海，朱 鵬，孫新楓

(1.陸軍勤務學院，重慶 401331；2.寧波大學海洋學院)

噴氣燃料在儲存、運輸、使用過程中不可避免地會有水分進入，燃料添加劑、儲運設施含有氮、磷等微量元素，這就為微生物生長繁殖創造了條件。而周圍環境中的微生物隨水分、灰塵等物質通過呼吸管路進入燃料中，引起噴氣燃料微生物污染[1-2]。噴氣燃料中的微生物污染不僅影響燃料的腐蝕性、潔凈性，而且降解燃料的組分和添加劑，影響噴氣燃料的性質[2-6]。研究表明[7-10]，枝孢霉菌是噴氣燃料的一種特征真菌，廣泛存在于噴氣燃料中。三磷酸腺苷(ATP)是生物體重要的能量載體，參與細胞新陳代謝的全過程，在細胞裂解后被釋放出來。熒光素酶可在ATP和Mg2+存在的環境下將蟲熒光素氧化成帶電激發狀態，而激發態分子回到基態過程中釋放光子[11]。可以通過儀器設備測定反應釋放的微弱光，再根據光強度推測ATP含量，進而計算出樣品中的微生物含量[12-13]。ATP檢測法是國際航空運輸協會推薦的噴氣燃料中微生物含量的檢測方法之一[14]。本研究通過測定不同時間點特征真菌在培養體系水相的發光強度，繪制枝孢霉菌生長曲線，隨枝孢霉菌生長繁殖，測定燃料總酸值等理化指標，考察噴氣燃料性質隨枝孢霉菌生長的變化，為判斷燃料污染等級提供依據。

1 實 驗

1.1 原料及儀器

試驗用油為3號噴氣燃料，取自中國石化鎮海煉化分公司；試驗用真菌為枝孢霉菌，本課題前期培養并鑒定過的真菌，保存于沙保氏平板培養基中；沙保氏液體培養基主要組分為4 g葡萄糖、1 g蛋白胨、100 mL去離子水。

試劑：氫氧化鉀、異丙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、吐溫80、二甲基硅油、葡萄糖，均為分析純，成都市科隆化學品有限公司生產；燦爛綠、酚酞，成都市科隆化學品有限公司提供；α-萘酚醌苯基甲烷(對萘酚苯)、氯烴基二甲基苯甲胺由上海麥克林生化科技有限公司提供；蛋白胨，由北京奧博星生物技術有限責任公司提供。

儀器：美國Thermo Fisher公司生產的ECO 1.2超凈工作臺；日本TOMY Digital Biology公司生產的SX-300快速自動高壓滅菌器；鄭州市亞榮儀器有限公司生產的SHB-ⅢA循環水式多用真空泵；承德鼎盛試驗機檢測設備有限公司生產的JYW-200C全自動表界面張力儀；上海泰邁儀器有限公司生產的SPX-30085-Ⅱ生化培養箱；合肥巔峰生物科技有限公司生產的ATP檢測儀；南京陵武新技術應用開發研究中心制造的NJ-1A石油產品腐蝕試驗多用儀；天津市賽得利斯實驗分析儀器公司生產的SHA-A水浴恒溫振蕩器；上海浦東榮豐科學儀器有限公司制造的202A-3數顯電熱恒溫干燥箱；美國Millipore公司生產的Milli-Q純水儀；玻璃砂芯過濾裝置由上海新亞凈化器件廠生產，濾膜0.22 μm。

1.2 試驗方法

1.2.1 構建培養體系①用250 mL三角燒瓶配制2組100 mL沙保氏培養液，并在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min；在超凈工作臺中，將在沙保氏平板培養基中保存的菌種分別接種至滅菌后的沙保氏液體培養基中，然后將接種后的沙保氏液體培養基放置在恒溫搖床上培養3天(轉速為180 rmin，溫度為27 ℃)。②將清洗后的1 L試劑瓶及過濾裝置滅菌(高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min)烘干后，用0.22 μm濾膜過濾噴氣燃料，除去噴氣燃料中的孢子[15]。③在超凈工作臺中，用滅菌沙保氏培養液、過濾3號噴氣燃料和培養3 天的枝孢霉菌構建如下培養體系：空白樣1為150 mL沙保氏培養液+850 mL 3號噴氣燃料；空白樣2為150 mL沙保氏培養液+菌液；試驗樣1～試驗樣5為150 mL沙保氏培養液+850 mL 3號噴氣燃料+菌液，其中，試驗樣1和試驗樣2用于測定發光強度，繪制枝孢霉菌生長曲線；試驗樣3～試驗樣5分別用于測定噴氣燃料上部樣品、中部樣品和下部樣品的性質。

1.2.2 枝孢霉菌ATP的檢測在試驗樣1和試驗樣2中分別接入10，100，1 000 μL菌液，放置于生化培養箱中培養(28 ℃)，每4 h檢測一次實驗樣品水相的發光強度，每個樣品檢測2～5次，取平均值；分別于試驗開始和結束時對空白樣水相的發光強度進行檢測。試驗時先搖動燒瓶中培養體系，使真菌在水相分布均勻后再取樣，用滅菌的移液管取1 mL水樣與1 mL裂解液在5 mL離心管中混合均勻，然后取50 μL混合液進行檢測，計算每毫升水中的微生物量。

1.2.3 噴氣燃料的總酸值及培養基pH的檢測按照GBT 12574《噴氣燃料總酸值測定》方法，每天分別取試驗樣3～試驗樣5中的上部樣、中部樣、下部樣檢測噴氣燃料的總酸值；于試驗開始和結束時檢測一次空白樣1中噴氣燃料的總酸值。取樣時上部樣在油面下方約1 cm處取，中部樣在油樣中間位置取，下部樣在油與培養液界面上方約1 cm處取。

1.2.4 噴氣燃料潔凈性檢測按照GBT 1793《航空燃料水反應試驗》方法，磷酸鹽緩沖溶液與噴氣燃料按體積比為1∶4取樣檢測噴氣燃料下部樣的潔凈性，同時按照GBT 22237《表面活性劑表面張力的測定》方法測試噴氣燃料的表面張力；每天取樣前觀察油相、水相以及界面處的狀態。

1.2.5 噴氣燃料銀片腐蝕試驗按照YLB15—2003方法，檢測噴氣燃料下部樣銀片腐蝕的級別，判斷是否有活性硫化物產生。

2 結果與討論

2.1 枝孢霉菌生長規律

以枝孢霉菌培養時間為橫坐標，各時間點所測的枝孢霉菌發光強度為縱坐標，繪制枝孢霉菌在培養體系中的生長規律，結果見圖1～圖3。從圖1～圖3可以看出：①枝孢霉菌接入培養體系后，由于缺乏充足的中間代謝產物，需要一個短暫的適應期以積累生長繁殖所必需的酶等物質，即遲緩期(0～4 h)，遲緩期內，枝孢霉菌繁殖速率較為緩慢，生長曲線平坦穩定，但代謝活躍，為下階段生長繁殖儲備了充足的酶、能量和中間產物；②經過遲緩期緩慢生長，水相發光強度達到400 RLUmL時，枝孢霉菌開始對數繁殖，生長曲線直線上升，由于初始接入量的不同，枝孢霉菌繁殖生長的基數不同，在100 μL接入量體系中繁殖生長速率比10 μL接入量體系中快，在更大接入量的1 mL培養體系中枝孢霉菌沒有經歷遲緩期，直接進入對數期快速生長，由于培養體系中營養物質不斷被消耗、有機酸等毒性代謝產物的積累以及pH下降等不利因素的影響，枝孢霉菌的繁殖速率逐漸下降，而死亡數目不斷上升，最終新增殖數與死亡數趨于平衡，總數處于相對穩定的狀態，枝孢霉菌的生長進入穩定期；③枝孢霉菌空白樣2(無噴氣燃料)與試驗樣的生長曲線基本一致，說明試驗過程中真菌的生長主要利用了水相培養液中的營養物質，并沒有大量利用噴氣燃料中的成分；空白樣2的發光強度有一個陡然下降然后再回升的過程，且培養體系初始接種量越大出現該趨勢的時間越早，說明真菌生長繁殖量有一個臨界點，超過該臨界點時由于營養物質不足會導致真菌數量減少，然后真菌數量再次上升并穩定在臨界點附近；試驗樣的發光強度雖然也有先下降后回升的趨勢，但該趨勢總體比空白樣2平緩，且出現的時間也略晚，說明雖然試驗過程中噴氣燃料不是枝孢霉菌營養物質的主要來源，但還是為真菌的生長提供了有利條件，促進了枝孢霉菌的生長。另外，試驗開始和結束時空白樣1(含噴氣燃料)的發光強度分別為106.8 RLUmL和120.0 RLUmL，變化不大，說明試驗過程中沒有外界其他菌種進入培養體系，消除了干擾因素。

圖1 10 μL接入量時的枝孢霉菌生長曲線■—試驗樣1； ●—試驗樣2； ▲—空白樣2。圖2、圖3同

圖2 100 μL接入量時的枝孢霉菌生長曲線

圖3 1 mL接入量時的枝孢霉菌生長曲線

2.2 噴氣燃料腐蝕性試驗

噴氣燃料總酸值隨時間的變化如圖4所示。從圖4可以看出，隨時間的延長，試驗組噴氣燃料的總酸值不斷增大，8天后試驗結束時上部樣、中部樣、下部樣總酸值分別從試驗開始時的0.005 3，0.005 4，0.005 5 mgKOHg增加到0.012 8，0.013 5，0.017 1 mgKOHg，下部樣的總酸值增加速率和幅度大于中部樣和上部樣，且第5天起下部樣的總酸值已經超出了GB 6537《3號噴氣燃料》規定的不大于0.015 mgKOHg的標準。但空白樣1在試驗開始和試驗結束時的總酸值分別為0.005 0 mg KOHg和0.005 7 mg KOHg，在沒有外界其他菌種干擾的情況下噴氣燃料的總酸值沒有明顯變化，且酸值在GB 6537《3號噴氣燃料》規定范圍內。

圖4 噴氣燃料總酸值隨時間的變化■—上部樣； ●—中部樣； ▲—下部樣

培養基pH隨時間的變化如圖5所示。從圖5可以看出，隨時間的延長，試驗組噴氣燃料的pH 呈逐步下降趨勢。這可能是枝孢霉菌在生長繁殖過程中產生了酸性物質，小分子有機酸溶于水相，降低了培養液的pH，大分子有機酸溶于油相，增加了噴氣燃料的總酸值。另外，試驗過程中銀片腐蝕級別沒有變化，試驗結果均為0級，說明試驗過程中，枝孢霉菌沒有分泌產生或僅分泌極少量活性硫化物，不足以影響到銀片腐蝕的試驗結果。

圖5 培養基pH隨時間的變化

2.3 噴氣燃料潔凈性變化

實驗初期，空白樣和試驗樣均清澈透明，油水界面處清潔干凈。隨著時間的延長，空白樣未發生明顯變化，但試驗樣油水界面處產生了一層白色薄膜，并逐漸變厚，局部有小顆粒狀物質出現。界面處的白色薄膜可能是枝孢霉菌菌絲相互連接形成的。噴氣燃料下部樣的表面張力隨時間的變化如圖6所示。從圖6可以看出，試驗過程中噴氣燃料的表面張力總體呈下降趨勢，這可能是枝孢霉菌代謝過程中產生了表面活性物質引起的。表面活性物質會增加油水乳化現象，使油中的水更加難以分離，這一方面會影響噴氣燃料的潔凈性，另一方面為微生物在油中的生長繁殖創造了條件，會促進微生物的生長繁殖。

圖6 下部樣的表面張力隨時間的變化

水反應試驗過程中，油相和水相均不存在乳化物或沉淀，兩相界面清澈、清潔，水反應試驗分離程度和界面現象均為1級。表明試驗過程中枝孢霉菌代謝繁殖產生的表面活性物質雖然降低了噴氣燃料的表面張力，但還不足以影響到水反應試驗。但長期積累的表面活性物質對噴氣燃料的性質有潛在影響，因此需要引起關注。

3 結 論

(1)枝孢霉菌在代謝繁殖過程中產生酸性物質和表面活性物質會增大噴氣燃料的總酸值、降低噴氣燃料的表面張力和溶解水的pH，同時影響噴氣燃料的潔凈性。

(2)噴氣燃料一旦滿足枝孢霉菌生長所需要的水分等條件，枝孢霉菌便會快速生長繁殖。因此在噴氣燃料儲存、使用、管理過程中，有必要定期檢測微生物污染情況，并采取有效處理措施。