早期帕金森病患者腦脊液生物標(biāo)志物及炎癥因子水平的研究

楊凌飛 劉愛(ài)華 耿一萌 項(xiàng) 志 滕軍放△

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1)神經(jīng)內(nèi)科 2)腫瘤科，河南 鄭州 450052

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床中常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，呈進(jìn)展性病程。流行病學(xué)研究顯示，帕金森病患者的平均發(fā)病年齡約為60歲，男性略多于女性[1]，臨床表現(xiàn)包括運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)癥狀[2-3]。運(yùn)動(dòng)癥狀主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、強(qiáng)直、震顫和行走不穩(wěn)，與黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失及α-突觸核蛋白異常沉積形成的路易小體有關(guān)[4-5]。目前，尚無(wú)特異敏感的生化指標(biāo)可作為早期帕金森病臨床診斷的依據(jù)。該領(lǐng)域的研究主要集中在腦脊液神經(jīng)元蛋白(α-syn、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白)水平上，但結(jié)論尚未統(tǒng)一[6-9]。本研究旨在評(píng)估早期帕金森病患者腦脊液中生物標(biāo)志物及炎癥因子水平及其相對(duì)比例在臨床早期階段的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1．1一般資料2016-09—2018-05收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診及住院早期PD患者及健康對(duì)照者，52例早期帕金森病患者(Hoehn-Yahr 1～2.5級(jí)為早期)，35例健康對(duì)照組，共87例自愿參與本研究，均由兩位神經(jīng)內(nèi)科運(yùn)動(dòng)障礙方面專(zhuān)家共同診治，符合國(guó)際帕金森病和運(yùn)動(dòng)障礙協(xié)會(huì)(MDS)2015年帕金森病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。2組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)愿意配合進(jìn)行UPDRS評(píng)分、H-Y分級(jí)等測(cè)試，接受腰穿腦脊液檢查者，并簽署知情同意書(shū)；(2)可使用普通話溝通交流；(3)年齡50～80歲。健康對(duì)照組需滿足沒(méi)有任何神經(jīng)及精神系統(tǒng)疾病。2組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有腫瘤和其他軀體嚴(yán)重疾病者，無(wú)法完成UPDRS評(píng)分等測(cè)試、腰穿腦脊液檢查；(2)3個(gè)月內(nèi)服用左旋多巴及其他可能影響認(rèn)知功能藥物者；(3)既往有腦炎、腦血管病、服用抗凝或抗精神病藥、重金屬中毒、腦積水等病史。本研究獲得了所有受試者的知情同意。

1．2方法

1．2．1 調(diào)查方法：①一般信息調(diào)查：收集姓名、性別、年齡等一般信息資料。②PD疾病情況調(diào)查：收集PD受試者病程、運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)癥狀及左旋多巴的服用情況，進(jìn)行帕金森綜合評(píng)分量表(unified parkinson’s disease rating scale，UPDRS) I-IV評(píng)分，評(píng)估運(yùn)動(dòng)障礙、日常生活行為、運(yùn)動(dòng)體征及運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥情況，結(jié)合改良Hoehn-Yahr分級(jí)量表(H-Y分級(jí))、簡(jiǎn)易智能狀態(tài)檢查量表(Mini mental state examination，MMSE)、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)輔助醫(yī)生進(jìn)行臨床診斷。

1．2．2 腦脊液檢查：收取患者腦脊液樣品，取2～3 mL腦脊液用于炎癥因子(TNF-α、CRP、IL-8)檢測(cè)，另取8～10 mL腦脊液收集在聚丙烯管中，并在提取10 min內(nèi)以2 000 g離心10 min，隨后將上清液儲(chǔ)存于-80℃。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒測(cè)定腦脊液中T-Tau、P-Tau和α-syn蛋白含量，通過(guò)單純分析蛋白濃度獲得各蛋白比例，使用T-Tau、α-syn蛋白作為分母來(lái)計(jì)算組合比率。1周后，囑受試者于相同時(shí)間段接受腦脊液炎癥因子檢測(cè)，取2次炎癥因子的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)所有樣本變量采用雙樣本t檢驗(yàn)。使用接受者操作特征曲線(ROC)分析確定診斷準(zhǔn)確性，并運(yùn)用曲線下面積(AUC)量化評(píng)估診斷的總體水平(AUC越接近1，總體診斷性能越好)[11]，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水平α=0.05，并選擇雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1PD受試組及健康對(duì)照組一般情況52例早期帕金森病受試患者中，因無(wú)法配合腰椎穿刺術(shù)排除4例(女，63、64、71歲；男，78歲)，因無(wú)法配合臨床檢查或量表評(píng)分排除1例(女，69歲)，其余47例早期帕金森病患者滿足納入標(biāo)準(zhǔn)。早期PD受試者UPDRS評(píng)分、MMSE評(píng)分顯著高于健康對(duì)照者(P<0.001)，PD受試者UPDRS評(píng)分、H-Y評(píng)分、MMSE評(píng)分、MoCA評(píng)分情況見(jiàn)表1。

2．2腦脊液生物標(biāo)志物及炎癥因子水平比較比較PD組與對(duì)照組腦脊液生物標(biāo)志物水平，PD組腦脊液中α-syn蛋白水平低于對(duì)照組(P=0.007)，PD患者腦脊液CRP、IL-8、總體Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白水平較對(duì)照組有所升高，其中CRP(P=0.009)、IL-8水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。以腦脊液中總體Tau蛋白濃度、α-syn蛋白濃度作為分母，以腦脊液中總體Tau蛋白、磷酸化的Tau蛋白作為分子，對(duì)比PD組與對(duì)照組后發(fā)現(xiàn)，PD組腦脊液T-Tau/α-syn及P-Tau/α-syn比例較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)，PD組腦脊液P-Tau/T-Tau比例較對(duì)照組未出現(xiàn)顯著性差異。見(jiàn)表2。

表1 2組一般情況比較

2．3腦脊液臨床診斷價(jià)值運(yùn)用ROC分析比較PD組與對(duì)照組生物學(xué)標(biāo)志物的敏感性及特異性，腦脊液CRP水平具有較低的診斷價(jià)值(AUC=0.619；敏感性=58.8%；特異性=63.4%)，而α-syn(AUC=0.804；敏感性=77.2%；特異性=72.9%)、IL-8(AUC=0.848；敏感性=69.6%；特異性=90.4%)和P-Tau/α-syn比例(AUC=0.890；敏感性=86.8%；特異性=80.3%)具有較高的診斷價(jià)值。由于腦脊液IL-8水平在2次腦脊液檢測(cè)結(jié)果中變異性較大，選取CRP水平與P-Tau/α-syn比例組合作為鑒別診斷的指標(biāo)，結(jié)果表現(xiàn)出更高的臨床診斷價(jià)值(AUC=0.931，敏感性=92.1%，特異性=78.0%)。見(jiàn)表3。

為評(píng)估帕金森病患者腦脊液生物標(biāo)志物及炎癥因子與簡(jiǎn)易智能狀態(tài)檢查量表(MMSE)評(píng)分的相關(guān)性，運(yùn)用Pearson相關(guān)性分析對(duì)PD患者腦脊液α-syn，總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白、炎癥因子(TNF-α、CRP、IL-8)及MMSE評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，C反應(yīng)蛋白、白介素IL-8、磷酸化Tau蛋白水平與MMSE評(píng)分間存在顯著相關(guān)性，其中，C反應(yīng)蛋白水平與MMSE評(píng)分存在較強(qiáng)負(fù)相關(guān)性。見(jiàn)表4。

3 討論

本研究旨在評(píng)估帕金森病患者腦脊液生物標(biāo)志物(α-突觸核蛋白、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白)及炎癥因子(CRP、IL-8、TNF-α)水平及其相對(duì)比例在臨床早期的診斷價(jià)值。α-突觸核蛋白和Tau蛋白是腦內(nèi)含量豐富的神經(jīng)蛋白，既維持正常的突觸功能，又與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，研究顯示，血漿Aβ、α-syn、T-Tau、P-Tau蛋白濃度變化與帕金森病的發(fā)病機(jī)制及運(yùn)動(dòng)障礙密切相關(guān)[12-13]。另有臨床研究表明，炎癥因子(CRP、IL-8、TNF-α)參與的免疫源性氧化應(yīng)激是導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體途徑神經(jīng)元變性的原因之一[14-15]，其在血漿、腦脊液的改變趨勢(shì)得到廣泛研究，但由于疾病嚴(yán)重程度、個(gè)體變異性、樣品處理方法、分析方法的差異，結(jié)果存在較大分歧[16-18]。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，PD患者腦脊液α-突觸核蛋白水平較正常者具有一定程度上的降低[19-20]，但將其作為鑒別早期PD患者的診斷依據(jù)尚不具有說(shuō)服力[19]。關(guān)于PD患者腦脊液α-突觸核蛋白減少的機(jī)制有以下幾種觀點(diǎn)：α-突觸核蛋白主要在神經(jīng)元內(nèi)沉積，而不是積聚在細(xì)胞外空間中；α-突觸核蛋白的沉積導(dǎo)致神經(jīng)元分泌功能活性降低；由于α-突觸核蛋白的播散導(dǎo)致正常神經(jīng)元中編碼α-突觸核蛋白的基因(SNCA)表達(dá)量減少，并使α-突觸核蛋白胞吐作用的下降[21]。本研究驗(yàn)證了臨床早期PD患者腦脊液α-突觸核蛋白水平較正常者顯著降低，為其用于輔助診斷臨床早期PD患者提供了新的支持。

表2 2組腦脊液生物標(biāo)志物及炎癥因子值比較

注：TNF-α、CRP、IL-8值為2次腦脊液檢測(cè)的平均值，*P<0.05

表3 腦脊液生物標(biāo)志物及炎癥因子在臨床診斷和鑒別診斷中的價(jià)值評(píng)估

注：*表示P-Tau /α-syn蛋白比例與CRP水平組合

表4 帕金森病患者腦脊液生物標(biāo)志物及炎癥因子與簡(jiǎn)易智能狀態(tài)檢查量表(MMSE)評(píng)分的相關(guān)性

注：N為樣本量，Pearson correlations為相關(guān)系數(shù)，*為相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

同時(shí)，PD患者腦脊液中Tau蛋白同種型(磷酸化的Tau蛋白)與α-突觸核蛋白兩者比例與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，PD患者腦脊液T-Tau/α-syn及P-Tau /α-syn蛋白比例顯著升高。一方面，Tau蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高的微管相關(guān)蛋白，其在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用，并參與神經(jīng)元軸突通訊傳導(dǎo)過(guò)程。在神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病)中，過(guò)度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)參與氧化自由基系統(tǒng)的啟動(dòng)，后者可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。另一方面，Lewy小體作為PD患者重要的病理改變，其主要由α-突觸核蛋白組成，但同時(shí)含有少量Tau蛋白，因此，相關(guān)研究顯示，Tau蛋白的異構(gòu)與α-突觸核蛋白的異常沉積連鎖導(dǎo)致帕金森病的病程進(jìn)展[22]。這一理論也得到Tau蛋白病如進(jìn)行性核上性麻痹(PSP)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)和突觸核蛋白病如PD的病理征重疊的支持[23-25]。本研究通過(guò)分析樣本數(shù)據(jù)得出，臨床早期PD患者腦脊液中總體Tau蛋白水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而磷酸化Tau蛋白水平較對(duì)照組升高，這提示臨床早期PD患者中總體Tau蛋白水平未出現(xiàn)明顯改變，但Tau蛋白的功能性及結(jié)構(gòu)性已經(jīng)被破壞。

最新Meta分析顯示，炎癥因子在PD與健康對(duì)照組之間存在顯著差異[9]，提示PD的發(fā)病機(jī)制可能伴隨機(jī)體炎癥反應(yīng)的失調(diào)。本文證實(shí)早期PD患者腦脊液C反應(yīng)蛋白及IL-8水平顯著升高，但I(xiàn)L-8水平在2次腦脊液檢測(cè)中變異性較大，提示腦脊液C反應(yīng)蛋白值有成為炎癥生物標(biāo)志物的潛能。將相對(duì)穩(wěn)定的C反應(yīng)蛋白值與PD相關(guān)生物標(biāo)志物(α-突觸核蛋白、Tau蛋白)水平結(jié)合，可進(jìn)一步增加對(duì)診斷臨床早期PD患者的診斷價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病患者腦脊液中生物標(biāo)志物及炎癥因子水平與認(rèn)知障礙程度相關(guān)，并通過(guò)Pearson相關(guān)分析帕金森病患者腦脊液中炎癥因子(TNF-α、CRP、IL-8)及α-syn，總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白水平與MMSE評(píng)分的相關(guān)性證實(shí)了該觀點(diǎn)，但是否與帕金森病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)尚待進(jìn)一步研究。有研究表明，C反應(yīng)蛋白是肝臟合成的一種炎癥誘導(dǎo)物質(zhì)，其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮母細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板都發(fā)揮強(qiáng)大的促炎作用，并可能放大炎癥反應(yīng)[26-30]。在長(zhǎng)期隊(duì)列研究中，帕金森病患者血清炎癥因子水平，如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10水平的升高與認(rèn)知障礙程度MMSE評(píng)分的降低之間存在顯著相關(guān)性，以此反映外周免疫反應(yīng)的促炎/抗炎因子平衡破壞與帕金森病認(rèn)知障礙程度存在關(guān)聯(lián)性[31-33]，但一直缺乏中樞神經(jīng)系統(tǒng)促炎/抗炎因子平衡紊亂的直接證據(jù)，本文通過(guò)研究C-反應(yīng)蛋白等炎癥因子與帕金森病認(rèn)知障礙程度的相關(guān)性分析，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)促炎/抗炎因子平衡紊亂及其與認(rèn)知障礙程度的關(guān)聯(lián)提供數(shù)據(jù)支持，對(duì)臨床預(yù)測(cè)帕金森病患者認(rèn)知障礙預(yù)后程度提供了新的思路。

本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示早期帕金森病患者腦脊液α-syn蛋白水平顯著降低，CRP、IL-8水平及T-Tau/α-syn、P-Tau/α-syn比例顯著升高，提示腦脊液α-syn，CRP水平及T-Tau/α-syn、P-Tau/α-syn比例可能具有帕金森病生物標(biāo)志物的潛能，其中C反應(yīng)蛋白與磷酸化的Tau蛋白/α-突觸核蛋白比例組合可更準(zhǔn)確的協(xié)助臨床早期診斷，提示。此外，早期PD患者腦脊液總體Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白濃度呈現(xiàn)小幅度升高，尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但隨著更大規(guī)模的臨床研究開(kāi)展，其變化趨勢(shì)及應(yīng)用潛能可獲得進(jìn)一步探討。