八種醫院中藥制劑微生物限度檢查方法的研究

謝鍇標 陳震堯 邱新華

[摘要]目的 建立皮癢寧洗劑、參榆結腸康灌腸液、痔瘺寶洗劑、婦炎寧洗劑、鉤蟬頭痛寧膠囊、傷科祛瘀片、舒肝行氣膠囊、壯腰健步丸等八種含抑菌成分的醫院中藥制劑微生物限度檢查方法。方法 根據2015版《中國藥典》第四部“1105、1106、1107”項下方法，以八種包含抑菌成分的中藥制劑為研究對象，分別選取3個批次實施微生物限度檢測。結果 微生物計數方法適用性試驗結果提示，采用稀釋法消除抑菌活性，可以采用平皿法測定，亦可采用薄膜過濾法進行微生物計數，兩者微生物計數回收比值均在0.5～2.0?？刂凭鷻z查適用性試驗結果提示，經過稀釋處理抑菌成分，結果均為陽性。結論 建立的方法準確可行，可用于八種醫院中藥制劑微生物限度檢查。

[關鍵詞]中藥制劑;微生物限度檢查;抑菌;方法驗證;2015版《中國藥典》

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（c）-0007-06

[Abstract] Objective To stablish the microbial limit test method for eight hospital Chinese materia medica preparations such as Piyangning Lotion， Shenyu Jiechangkang Enema， Zhiloubao Lotion， Fuyanning Lotion， Gouchan Toutongning Capsules， Shangke Quyu Tablets， Shugan Xingqi Capsules， Zhuangyao Jianbu Pills， etc. which contain antibacterial components. Methods According to the methods mentioned under Part Ⅳ “1105， 1106 and 1107” of Version 2015 Chinese Pharmacopoeia， the 8 Chinese materia medica preparations which contain antibacterial components were taken as the research objects， and 3 batches were selected for implementing the microbial limit test. Results The results of the applicability test of the microbial count method suggest that the antibacterial activity can be eliminated by dilution method， which can be determined by plate method or by membrane filtration method. The recovery ratio of the microbial count of both methods was 0.5-2.0. The results of the suitability test of the control bacteria showed that all the bacteriostatic components were positive after dilution treatment. Conclusion Establishing method is correct and feasible， which could be used for microbial limit test of eight hospital Chinese materia medica preparations.

[Key words] Traditional Chinese medicine preparation; Microbial limit test; Bacteriostasis; Method validation; Version 2015 Chinese Pharmacopoeia

中藥制劑為包含多種物質的復合制劑，不管是何種物質具備抑菌效果[1]，都能夠影響到微生物限度檢查的精確性，所以對中藥制劑進行微生物限度檢查時需首先檢測方法的適用性，才能保證檢查方法的完整性和準確性。本文八種中藥制劑為特色制劑，其微生物限度檢查法在各級藥品標準中均無收載。依據2015版《中國藥典》第四部要求，建立了微生物限度檢查法并進行了驗證，能客觀地反映藥物中微生物的污染狀況，達到有效、可控的檢測目的。

與2010版《中國藥典》相比，2015版《中國藥典》中對微生物限度檢查進行了較大的修訂[2-3]，培養基更改為廣譜性的胰酪大豆瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂，微生物計數改為需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，對回收試驗等要求和內容也進行了對應的修訂，方法更傾向于與國際接軌。本文針對含有抑菌成分的中藥制劑，采用平皿法和薄膜過濾法兩種方法去驗證，平皿法具有簡單、經濟的特點;薄膜過濾法具有準確性高，重復性好的特點[4]。通過比較兩種方法，開展研究與驗證，對該類藥物微生物限度檢查方法制定有一定參考和借鑒意義，現報道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

YXQWF32-500臥式榘形壓力蒸氣消毒器（湖南衡陽醫療器械廠）;BHC-1300ⅡA-B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司）;SZX型超凈工作臺（上海滬南科學儀器聯營廠）;LRH-250A生化培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）;CX31生物顯微鏡（奧林巴斯）;MJ-160B-Ⅱ霉菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）;HTY HOMO761勻漿儀（浙江泰林生物技術股份有限公）;420-A型電熱恒溫水浴箱（姜堰市新康醫療器械有限公司）;JA2003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;JC101型電熱鼓風干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司、南通嘉程儀器有限公司合作出品）。

1.2供試品

皮癢寧洗劑、參榆結腸康灌腸液、痔瘺寶洗劑、婦炎寧洗劑、鉤蟬頭痛寧膠囊、傷科祛瘀片、舒肝行氣膠囊、壯腰健步丸的批號信息詳見表1。

表1? ?八個中藥制劑的生產信息

1.3菌種

實驗中運用到的菌株其傳代次數不可大于5代[5]，且使用科學的方式進行保存[6]，以保證菌株良好是生物學特點。

金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、生孢梭菌（clostridumsporogens）[CMCC（F）64941]、銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌（salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌種均來自于中國食品藥品檢定研究院。

1.4培養基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：3106021）、胰酪大豆胨液體培養基（批號：1074651）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：1064381）、沙氏葡萄糖液體培養基（3105054）、麥康凱瓊脂培養基（批號：1064721）、麥康凱液體培養基（批號：3106271）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：3104915）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：3105002）、梭菌增菌培養基（批號：3104496）、哥倫比亞瓊脂培養基（批號：3104758）、RV沙門增菌液體培養基（批號：3104847）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號：1074121）、腸道菌增菌液體培養基（批號：3105454）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號：3104750）、念珠菌顯色培養基（批號：3104798）、三糖鐵瓊脂培養基（批號：3105052）、硫乙醇酸鹽流體培養基（批號：3105365）、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：3105256）均產自廣東環凱微生物科技有限公司;聚山梨酯80（批號：20141022），產自天津市富宇精細化工有限公司;二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺（批號：1604005），產自阿拉丁試劑（上海）有限公司;氯化鈉（批號：20160202-2）、過氧化氫（批號：920150701-1）、丙三醇（批號：20160201-1），產自廣州化學試劑廠。

本研究所用到的培養基均按使用說明配制及消毒，所用試劑也要按需經過121℃，30 min蒸汽滅菌[7]。

2方法與結果

參照2015 《中國藥典》版四部“1105、1106、1107”微生物限度檢查法[8]進行驗證。

2.1供試品溶液的制備方法設計

2.1.1不含藥材原粉的膠囊劑供試品制備

鉤蟬頭痛寧膠囊、舒肝行氣膠囊，分別稱取10 g，用勻漿儀打碎，加入100 ml胰酪大豆胨液體培養基，慢慢搖至均勻，制成1∶10供試品，再用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋液，配制1∶100供試品[9]。

2.1.2含藥材原粉的固體制劑制備

傷科祛瘀片、壯腰健步丸，分別稱取10 g，加入100 ml胰酪大豆胨液體培養基，用勻漿儀制成1∶10供試品，再用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋液，配制1∶100供試品[10]。

2.1.3外用液體供試品制備

皮癢寧洗劑、參榆結腸康灌腸液、痔瘺寶洗劑、婦炎寧洗劑，各取一瓶搖勻，作為供試品，再各取10 ml，以胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋液，分別制成1∶2供試品、1∶5供試品、1∶10供試品、1∶20供試品[11]。

2.2菌液制備

2.2.1高濃度菌懸液的制備

依次將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌的新鮮培養物接種到胰酪大豆胨液體培養基內，該培養基體積為100 ml，將生孢梭菌接種到硫乙醇酸鹽流體培養基內，體積同樣為100 ml，然后置于溫度為30～35℃生化培養箱內，連續培養18～24 h;將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養基內，體積同樣為100 ml，然后置于溫度為20～25℃的培養箱內培養2～3 d;依次量取10 ml的培養物，除生孢梭菌的培養物需使用硫乙醇酸鹽流體培養基進行稀釋外，其他種類的培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，分別取各培養物10 ml，加稀釋液90 ml，按10倍遞增稀釋級數制成每毫升含菌數為1000～10 000 cfu的菌懸液。

將黑曲霉培養物接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDB）表面，然后置于溫度為20～25℃的生化培養箱內，連續培養5～7 d，之后用含0.05%（ml/ml）吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗孢子。然后借助無菌吸管把孢子懸液轉移至無菌燒瓶中，用上述沖洗液將懸液稀釋成含菌數1000～10 000 cfu/ml的孢子懸液。

2.2.2低濃度菌懸液的制備

取“2.2.1”項下制備的各菌懸液，進一步稀釋成含菌數小于100 cfu/ml的菌懸液，用于定性致病菌檢查方法及微生物計數法中薄膜過濾法的研究。

2.3供試品微生物計數方法的設計

2.3.1平皿法設計

需氧菌總數[12]：固體制劑選用（1∶10，1 ml）供試品和（1∶100，1 ml）供試品，必要時選用（1∶1000，1 ml）和（1∶10 000，1 ml）。

液體制劑選用（原液，1 ml）供試品和（1∶10，1 ml）供試品，必要時選用（1∶20，1 ml）供試品和（1∶50，1 ml）供試品。

霉菌和酵母菌總數：固體制劑選用（1∶10，1 ml）供試品，必要時選用（1∶20，1 ml）供試品。

液體制劑選用（原液，1ml）供試品和（1∶2，1 ml）供試品，必要時選用（1∶5，1 ml）供試品和必要時選用（1∶10，1 ml）供試品。

2.3.2平皿法回收率的設計

2.3.2.1試驗組? 取選用濃度的供試品，每份100 ml，依次添加“2.2.1”項下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，添加量需小于1 ml。吸取1 ml移至平皿內，制作2個平行樣，倒入相應的培養基。

2.3.2.2菌液對照組? 取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替“試驗組”的供試品，同法制備。

2.3.2.3供試品對照組? 取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替“試驗組”的菌懸液，同法制備。

上述相應的培養基及培養溫度為：對需氧菌進行統計時需使用胰酪大豆胨瓊脂培養基在30～35℃的條件下進行培養;對霉菌于酵母菌進行統計時需使用沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDB）在20～25℃的溫度中培養。

2.3.3薄膜過濾法計算微生物回收率的設計

2.3.3.1試驗組? 取1∶10供試液10 ml，抽濾過，選擇一定量pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，100 ml/次，于末次沖洗結束之后，加入“2.2.2”的相應菌懸液1 ml，濾過，取出濾膜，平行制備2張貼膜，分別貼于相應培養基上培養[13]。

2.3.3.2菌液對照組? 按薄膜過濾法，加入“2.2.2”的相應菌懸液1 ml，濾過，取出濾膜，平行制備2張貼膜，分別貼于相應培養基上培養。

2.3.3.3供試品對照組? 取pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替“試驗組”的菌懸液，同法制備。

上述相應的培養基及培養溫度為：需氧菌計數所使用到的貼膜貼在胰酪大豆胨瓊脂培養基平皿中30～35℃的條件下培養;霉菌與酵母菌計數所使用到的貼膜貼在沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDB）平皿中20～25℃的溫度中培養。

2.3.3.4預實驗? 采用金黃色葡萄球菌作為試驗菌株進行預實驗，結果使用200 ml緩沖液，每次100 ml，八個品種的回收率能達到0.5～2.0，初步確認使用薄膜過濾法（200 ml）可以消除制劑的抑菌作用。

2.3.4回收率的計算

各菌株的回收率=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液對照組的平均菌落數×100%

按照要求，回收率在0.5～2.0之間，供試品3個批次中若有1個超出比值，需用進一步用適宜的方法進行試驗。計算各試驗菌株回收率，結果見表2。

2.4控制菌檢查方法的設計及驗證

根據八種制劑的處方、工藝、劑型等特點，本設計需進行耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌等方法適應性研究，所試驗的菌種包含了藥典全部致病菌。（注：若陽性對照組沒有顯示出對應菌株活性，則該濃度下菌株被抑制，需各組再等量加入稀釋液稀釋，直到陽性對照組的致病菌菌株被培養出來。）

2.4.1耐膽鹽革蘭陰性菌檢查驗證試驗

取2.1項下1∶10供試液于20～25℃培養2 h，成為預培養供試液[14]。

供試品對照組：取10 ml預培養物供試液加入10 ml腸道菌增菌液體培養基。

陽性（大腸埃希菌）組：照供試品組配制，再加入“2.2.2”項下大腸埃希菌液1 ml。

陽性（銅綠假單胞菌）組：照供試品組配制，再加入“2.2.2”項下銅綠假單胞菌液1 ml。

陰性組：以胰酪大豆胨液體培養基代替“預培養物”，照供試品組配制，再加入稀釋液1 ml。

放于30～35℃的生化培養箱內培養24～48 h，之后劃線接種在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基的平板中，在同一溫度條件的培養箱內進行培養，分析與記錄菌落狀態。結果見表3。

表3? ?2品種耐膽鹽革蘭陰性菌驗證結果

2.4.2大腸埃希菌檢查驗證試驗

供試品對照組：取2.1項下1∶10供試液10 ml加入到100 ml胰酪大豆胨液體培養基，再加入稀釋液1 ml。

陽性（大腸埃希菌）組：按照供試品組，取“2.2.2”項下大腸埃希菌液1 ml代替稀釋液進行配制。

陰性對照組：按照供試品組，取稀釋液10 ml代替“1∶10供試液”進行配制。

置30～35℃的生化培養箱中培養18～24 h后，將其1 ml添加至100 ml麥康凱液體培養基上，放于42～44℃條件下培養24～48 h，之后劃線接種在麥康凱瓊脂平板中[15]，于30～35℃條件下培養18～72 h，并分析與記錄菌落狀態。結果見表4。

2.4.3沙門菌檢查驗證試驗

供試品對照組：取2.1項下1∶10供試液100 ml，再加入稀釋液1 ml。

陽性（沙門菌）組：按照供試品組，取“2.2.2”項下沙門菌液1 ml代替稀釋液進行配制。

陰性對照組：按照供試品組，取稀釋液100 ml代替“1∶10供試液”進行配制。

放于30～35℃的生化培養箱內培養18～24 h之后，將0.1 ml培養物，接種到10 ml RV沙門增菌液體培養基上。于30～35℃條件下培養18～24 h，之后劃線接種在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂的培養基中。于30～35℃條件下培養18～48 h，借助接種針篩選疑似菌落，并給予斜面與高層穿刺處理，繼而接種在三糖鐵瓊脂培養基中，在30～35℃條件下培養18～24 h，并分析與記錄菌落狀態[16]。檢查沙門菌：鉤蟬頭痛寧膠囊加入培養基的體積不少于200 ml，舒肝行氣膠囊加入培養基的體積不少于300 ml。結果見表5。

表5? ?4品種沙門菌驗證結果

2.4.4銅綠假單胞菌檢查驗證試驗

供試品對照組：把2.1項下1∶10供試液添加至100 ml胰酪大豆胨液體培養基內，再加入稀釋液1 ml。

陽性（銅綠假單胞菌）組：按照供試品組，取“2.2.2”項下銅綠假單胞菌液1 ml代替稀釋液進行配制。

陰性對照組：按照供試品組，取稀釋液10 ml代替“1∶10供試液”進行配制。

置30～35℃的生化培養箱中培養18～24 h后，劃線接種至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72 h，后挑疑是菌落做過氧化酶試驗，若培養物30 s內呈粉紅色并逐漸變為紫紅色則為氧化酶試驗陽性[17]。結果見表6。

2.4.5金黃色葡萄球菌檢查驗證試驗

供試品對照組：將2.1項下1∶10供試液添加至100 ml胰酪大豆胨液體培養基內，之后添加稀釋液1 ml。

陽性（金黃色葡萄球菌）組：按照供試品組，取“2.2.2”項下金黃色葡萄球菌液1 ml代替稀釋液進行配制。

陰性對照組：按照供試品組，取稀釋液10 ml代替“1∶10供試液”進行配制。

置30～35℃的生化培養箱中培養18～24 h后，劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72 h，觀察菌落形態[18]。結果見表7。

表7? ?4品種金黃色葡萄球菌驗證結果

2.4.6梭菌檢查驗證試驗

供試品組：取2.1項下1∶10供試液2份，每份10 ml，其中一份置80℃保溫10 min后冷卻。上述2份供試液各加入1 ml稀釋液并分別接種至100 ml梭菌增菌培養基中。

陽性對照組：按照供試品組，取“2.2.2”項下梭菌菌液1 ml代替稀釋液進行配制。

陰性（梭菌）組：按照供試品組，取稀釋液10 ml代替“1∶10供試液”進行配制。

置厭氧條件下30～35°C培養48 h后，涂抹接種至哥倫比亞瓊脂培養基平板上，厭氧條件下30～35℃培養48～72 h，取疑是菌落滴加3%過氧化氫試液，若菌落表現有氣泡產生，則為陽性[19]。

結果提示，使用100 ml梭菌增菌培養基，陽性（梭菌）組即顯示出梭菌活性。

2.4.7白色念珠菌檢查驗證試驗

供試品組：取2.1項下1∶10供試液加入到100 ml沙氏葡萄糖液體培養基中，再加入稀釋液1 ml。

陽性（白色念珠菌）組：按照供試品組，取“2.2.2”項下白色念珠菌液1 ml代替稀釋液進行配制。

陰性對照組：按照供試品組，取稀釋液10 ml代替“1∶10供試液”進行配制。

置30～35℃的生化培養箱中培養72～120 h后，劃線接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養24～48 h，然后挑選疑是菌落接種至念珠菌顯色培養基平板上[20]，觀察菌落形態。

結果提示，使用100 ml沙氏葡萄糖液體培養基，陽性（白色念珠菌）組即顯示出白色念珠菌活性。

3討論

本文中八種醫院中藥制劑均含有抑菌成分，通過試驗，建立了微生物限度檢查方法。其中，需氧菌總數計數用平皿稀釋法和薄膜過濾法，霉菌和酵母菌計數：皮癢寧洗劑用1∶2稀釋，參榆結腸康灌腸液、痔瘺寶洗劑、婦炎寧洗劑用原液，鉤蟬頭痛寧膠囊、傷科祛瘀片、舒肝行氣膠囊、壯腰健步丸用1∶10稀釋，回收率在0.5～2.0之間。由“2.4”的試驗可見，八種醫院制劑的致病菌檢查，除檢查沙門菌時，鉤蟬頭痛寧膠囊稀釋液用200 ml，舒肝行氣膠囊的稀釋液用300 ml外，其余用常規法，各控制菌均可被檢查出來。

2015年版《中國藥典》，其修訂后的中國藥典微生物檢驗系統與國外完全一致。使原本國內國外有兩套微生物檢驗方法的生產企業，大大的減少了檢驗成本。

藥典上的致病菌驗證沒有明確規定要做供試品對照組，本文加入供試品對照組的目的是為了證明供試品沒有被污染，更加有力的證明方法可行性。

膠囊劑型或皂苷類成份多的中藥制劑，用勻漿儀加液后打碎容易產生泡沫，對加入的菌種會有影響，可選擇打碎后加入稀釋液，再攪拌均勻。

微生物試驗時，中藥膠囊劑常常會遇到膠囊殼不易溶解的情況，為了不影響填充物內的微生物生長，可將打勻后的膠囊液置45℃水浴并時時震搖，使溶解[21]。

本研究建立了皮癢寧洗劑、參榆結腸康灌腸液、痔瘺寶洗劑、婦炎寧洗劑、鉤蟬頭痛寧膠囊、傷科祛瘀片、舒肝行氣膠囊、壯腰健步丸的微生物限度檢查，所用菌株涵蓋了2015版《中國藥典》的所有試驗菌株。試驗菌株的稀釋濃度會因其活性生物，接種量、生長溫度、培養時間、活化代數、個人操作等影響，筆者所探究的所有試驗菌株濃度依次為：銅綠假單胞菌8×106 cfu/ml、枯草芽孢桿菌107 cfu/ml、金黃色葡萄球菌5×108 cfu/ml、白色念珠菌7×106 cfu/ml、大腸埃希菌3×108 cfu/ml、乙型副傷寒沙門菌2×108 cfu/ml、黑曲霉和生孢梭菌可以稀釋制備成同濃度多份，孢子懸液保存于2～8℃，在驗證貯存期內使用，測定其中1份濃度即可。試驗菌株濃度在藥典上沒有公布，在同類文獻中亦少見，現列出培養后的菌株濃度可供同行人員參考。

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（收稿日期：2018-01-04? 本文編輯：孟慶卿）