枸杞內生酵母菌的篩選及其發酵特性研究

李亞輝，梁 穎，王 英，周劍忠*，蒲 青，趙慧芳

（1.江蘇省農業科學院 農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇省農業科學院 農產品安全與營養研究所，江蘇 南京 210014；3.青海昆侖河枸杞有限公司，青海 海西州 816102；4.樂享世紀（天津）科技有限公司，天津 100199）

枸杞（Lycium sinensisMill）為茄科落葉灌木，在全球共有97個品種，其中有31種已經被廣泛應用于食品和藥品領域[1]。中國枸杞主要分布在西北地區，如寧夏和柴達木盆地，其中柴達木枸杞已占該地區農牧業總產值的50.4%[2-3]。枸杞含有豐富的營養物質和生物活性成分（如枸杞多糖、甜菜堿、氨基酸、胡蘿卜素、尼克酸和微量元素等），具有免疫調節、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、補肝益腎、降血脂和降血糖等功效，是一種良好的“藥食同源”食品[4-6]。

枸杞作為藥食兩用性植物深受人們青睞，但其商品形式比較單一，商業價值有待被挖掘。新鮮枸杞水分和糖含量高，不易儲存、保質期短，目前主要進行干制品加工[7]。以枸杞鮮果為原料開發產品，具有減少資源浪費、有效保留營養成分和生物活性物質等優點。新鮮枸杞汁液豐富、顏色深厚、果香濃郁，且具有較高的營養和保健功能，是釀造保健型果酒的良好原料[8]。加工釀造枸杞酒不僅可最大限度保留原料中的營養成分，而且通過生物發酵還可產生大量生物活性物質和保健功能因子，是提高枸杞附加值的重要途徑[9-10]。目前枸杞果酒已在市場上出現，但其發酵技術主要參照葡萄酒的釀造工藝，其品質還有待提高[11]。酵母對發酵過程及果酒品質至關重要，目前枸杞酒的釀造主要采用葡萄酒釀造商業化酵母，不能完全體現出枸杞獨特的風味[12]。因此，篩選枸杞專用釀酒酵母是提高枸杞酒整體品質的重要途徑。

本研究以青海海西州都蘭縣（柴達木盆地）新鮮枸杞為原料，通過自然發酵分離出枸杞內生酵母，并對其發酵特性進行研究，以期篩選出具有良好發酵性能的枸杞專用釀酒酵母，改善枸杞酒風味，提高枸杞酒品質，為枸杞酒的工業化生產提供一定的理論依據和技術支持，促進枸杞產業的多元化發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮枸杞：青海海西州都蘭縣青海昆侖河枸杞有限公司。

果膠酶（4萬U/g）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：上海杰兔工貿有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；酵母浸膏、蛋白胨（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；酚酞、蒽酮（均為分析純）：上海浦口化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PSH-300生化培養箱：中科生命科技股份有限公司；SJ-CJ-2FQ潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-200電熱干燥培養箱：南京實驗儀器廠；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩機：太倉市實驗設備廠；XSP-4C顯微鏡：上海繪統光學儀器廠；SevenEasy plus pH儀：梅特勒-托利多儀器上海股份有限公司；723型可見分光光度計：上海精密科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞酒自然發酵工藝流程及操作要點

操作要點：選擇無腐爛、無雜質的新鮮枸杞，打漿后，立即加入0.01%偏重亞硫酸鉀（相當于0.005%的二氧化硫），攪拌均勻。然后加入0.3%果膠酶，35℃酶解2～3 h，再按質量比加入10%的蔗糖，攪拌均勻，25℃條件下恒溫發酵。當糖含量降低約13%時，取樣分離酵母，當殘糖量＜4 g/L時發酵結束，立即分離，常溫自然澄清2周后，用硅藻土下膠，-2℃條件下處理一周，采用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾、灌裝。

1.3.2 酵母菌的分離

當枸杞發酵液中糖含量降低約13%時，取樣，然后按照湯衛華等[13-14]的方法分離酵母：取發酵液100 μL，采用10倍梯度稀釋法稀釋至10-4～10-9，分別吸取0.5 mL稀釋液轉入YPD固體平板培養基，涂布均勻，于28℃培養48 h，挑選光滑的單菌落10個，在YPD固體平板上劃線并于28℃培養48 h，再次挑選單菌落在試管斜面上劃線，于28℃培養，4℃保存備用。

1.3.3 酵母菌的篩選

通過分離酵母菌形態的觀察、產氣性能、產酒精力及發酵力的測定，篩選優良酵母。

形態觀察：挑取斜面上的單菌落劃線于YPD平板，28℃條件下培養48 h，觀察并記錄菌落的質地、顏色和表面特征。挑選表面光滑、球形、不透明、奶油狀的單菌落進行鏡檢，觀察并記錄細胞形態、繁殖方式等。

產氣性能測定：采用杜氏管發酵法[15]測定初步篩選出的酵母菌的產氣能力，記錄產氣時間和產氣量，重復測定3次。

產酒精力測定：參照牛廣財等[16]的方法。按照接種量1×107CFU/mL將酵母菌接種于YPD培養基，28℃、100 r/min條件下發酵8 d，測定發酵液的酒精度并由感官評定小組對發酵液的酒香和發酵香氣進行感官評定，重復測定3次。

發酵力測定：采用CO2失重法[16]測定初篩酵母菌的發酵能力。按接種量1×107CFU/mL將酵母菌接種于YPD培養基，28℃、100 r/min條件下培養8 d，每隔12 h測定1次質量，重復測定3次。以發酵時間（x）為橫坐標，CO2質量損失（y）為縱坐標，繪制發酵力曲線。

1.3.4 酵母菌耐受性的測定

參照王榮榮等[17]的方法對篩選酵母菌的耐受性進行測定。調整YPD培養基的葡萄糖含量（200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L），乙醇含量（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol）和SO2含量（150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L），按5%（0.6×106CFU/mL）的接種量接種篩選酵母菌株，于28℃、100r/min條件下發酵48h，分別以葡萄糖質量濃度為20g/L、不添加乙醇、不添加SO2為對照，采用血球計數板測定發酵液中的菌體數，每組3個平行。

1.3.5 理化指標測定及感官評定

按照方法1.3.1工藝流程，向枸杞汁中添加8%蔗糖，接種優良酵母，28℃條件下恒溫發酵，每天攪拌一次并測定殘糖量，當發酵液殘糖量＜4 g/L時，記錄發酵時間并取樣。參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定發酵液的總酸、總糖、總SO2含量、游離SO2含量、pH值和酒精度。參照周書來等[18]的方法對產品進行感官評定，感官評定由8位經驗豐富、具有專業知識的人員組成感官評定小組。

1.3.6 數據分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0數據處理軟件進行數據處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 枸杞酒自然發酵酵母菌的分離

當枸杞發酵液中糖含量降低約13%時，取樣分離酵母，從稀釋度為10-8平板上挑選10個光滑的單菌落進行平板劃線，分離得到10株菌株，編號為G1～G10，其中菌株G1、G3和G8的平板劃線結果如圖1所示。

圖1 分離菌株平板劃線結果Fig.1 Plate streaking results of isolated strains

由圖1可知，菌株G1、G3和G8菌落形態較大，圓形、有突起，顏色為乳白色，且表面光滑，符合酵母菌的菌落特征。

2.2 枸杞酒自然發酵酵母的篩選

2.2.1 形態觀察

分離菌株G1～G10的細胞形態和菌落形態見圖2和表1。

圖2 分離酵母菌的細胞形態Fig.2 Cell morphology of isolated yeasts

表1 分離菌株的菌落形態和細胞形態Table 1 Colony and cell morphology of isolated strains

由圖2和表1可知，菌株G1、G2、G3、G4、G8和G9的菌落形態及細胞形態基本一致，菌落為圓形、突起、白色或乳白色、光滑、有酒香味，細胞為圓形或橢圓、出芽生殖，符合酵母菌特征。菌株G5的菌落形態為圓形、扁平、淡黃色且無酒香味，細胞為橢圓形、無芽體；菌株G6的菌落形態為圓形、扁平、白色且無酒香味，細胞為長桿形、無芽體；菌株G7和G10的菌落形態為圓形、扁平、淡黃色或白色且無酒香味，細胞為橢圓、有芽體。根據菌落和細胞形態特征初步篩選出菌株G1、G2、G3、G4、G8和G9為酵母菌[13-14]。

2.2.2 產氣性能測定

對獲得的6株酵母菌G1、G2、G3、G4、G8和G9進行產氣性能測定，結果見表2。

表2 6株酵母菌的產氣性能測定結果Table 2 Determination results of gas-producing performance for 6 yeasts

由表2可知，28℃條件下發酵12 h時，菌株G2、G4和G9的產氣量為杜氏管體積的1/3，菌株G1、G3和G8產氣量為杜氏管體積的2/3；發酵24 h時，菌株G2和G9的產氣量為杜氏管體積的2/3，其余4株酵母菌的產氣量為杜氏管滿體積，結果表明，酵母菌G1、G3、G4和G8具有較強的產氣能力。

2.2.3 產酒精力測定

對6株酵母菌的產酒精力進行測定，并在培養后進行香氣感官評定，結果見表3。

表3 6株酵母菌的產酒精力和香氣評定結果Table 3 Results of liquor-producing capacity and aroma evaluation for 6 yeasts

由表3可知，菌株G1、G4和G8具有強的產酒精能力，發酵液的酒精度分別為10.4%vol、10.2%vol、10.8%vol，其次為菌株G3（9.8%vol），菌株G2和G9的產酒精力較差，發酵液的酒精度分別為6.5%vol、7.4%vol。菌株G1、G3和G8發酵后均具有典型的發酵果香和酒香，菌株G4香氣一般。結果說明，菌株G1和G8不僅具有較強的產酒精能力，且發酵后還產生較好的酒香和果香。

2.2.4 發酵力測定

對產氣能力和產酒精能力較強的菌株G1、G3、G4和G8進行發酵力測定，結果見圖3。

由圖3可知，在發酵過程中，菌株G1和G8的CO2產生量明顯高于菌株G3和G4；菌株G1在發酵前3 d產生的CO2較高，為發酵旺盛期，發酵第48小時時，CO2產生量最大，CO2質量損失為3.1 g），然后隨著發酵時間的延長，CO2產生量逐漸下降；菌株G8在發酵前4 d，CO2產生量較大，為發酵旺盛期，發酵第36小時時，CO2產生量最大，CO2質量損失為3.3 g，然后隨著發酵時間的延長，CO2產生量逐漸下降。結果說明，菌株G1和G8具有較強的發酵能力，且明顯高于菌株G3和G4。

圖3 酵母菌G1、G3、G4和G8的發酵力曲線Fig.3 Fermentation capacity curves of yeast G1,G3,G4 and G8

通過形態觀察、產氣性能、產酒精力和發酵力的測定，篩選出菌株G1和G8為發酵性能良好的酵母菌，并對這兩株酵母菌的耐受性進行研究。

2.3 酵母菌耐受性的測定

2.3.1 SO2耐受性測定

酵母菌G1和G8的SO2耐受性測定結果如圖4所示。

圖4 不同SO2含量對篩選酵母生長的影響Fig.4 Effect of different SO2content on growth of isolated yeasts

由圖4可知，隨著SO2含量的增加，菌株G1和G8的菌體數逐漸降低；當SO2含量≤200mg/L時，SO2含量對兩株酵母菌的生長幾乎無影響（P＞0.05）；當SO2含量為250 mg/L時，SO2含量對兩株菌的生長有顯著影響（P＜0.05）；當SO2含量為300 mg/L時，SO2含量對兩株菌的生長有極顯著影響（P＜0.01）；當SO2含量在250～350 mg/L范圍內時，菌株G8對SO2的耐受性較菌株G1好。結果表明，菌株G1和G8最高可耐受250mg/L的SO2。通常情況下，果酒釀造中SO2含量＜200 mg/L[19]，因此，在SO2耐受性方面，菌株G1和G8完全可以滿足釀酒的需要。

2.3.2 乙醇耐受性測定

酵母菌G1和G8的乙醇耐受性測定結果如圖5所示。

圖5 不同乙醇含量對篩選酵母生長的影響Fig.5 Effect of different content of ethanol on growth of isolated yeasts

由圖5可知，隨著乙醇含量的增加，菌株G1和G8的菌體數逐漸降低，當乙醇含量為10%vol～14%vol時，對兩株菌的生長影響較小（P＞0.05）；菌株G8在乙醇含量為16%vol時，菌體數明顯下降，而菌株G1在乙醇含量為18%vol時明顯下降；在不同乙醇含量下菌株G1對乙醇的耐受性較菌株G8好，在高乙醇含量下尤其明顯。結果表明，菌株G1的乙醇耐受性優于菌株G8，菌株G1最高可耐受16%vol乙醇，菌株G8最高可耐受14%vol乙醇。通常情況下，果酒的酒精度≤12%vol[19]，因此，在乙醇耐受性方面，菌株G1和G8完全可以滿足釀酒的需要。

2.3.3 糖耐受性測定

酵母菌G1和G8的糖耐受性測定結果如圖6所示。

圖6 不同糖含量對篩選酵母生長的影響Fig.6 Effect of different sugar content on growth of isolated yeasts

由圖6可知，隨著糖含量的增加，菌株G1和G8的菌體數逐漸降低，當糖含量≤250 g/L時，對兩株菌的生長影響較小（P＞0.05%）；當糖含量為300 g/L時，對菌株G1的生長有明顯抑制作用（P＜0.05），而菌株G8在糖含量為350 g/L時，菌體數明顯下降（P＜0.05）；在不同糖含量下菌株G8對糖的耐受性優于菌株G1，在高糖含量下尤其明顯。結果表明，菌株G8的糖耐受性優于菌株G1，菌株G1最高可耐受250g/L的糖，菌株G8最高可耐受300g/L的糖。通常情況下，發酵液中糖含量≤250 g/L[20]，因此，在糖耐受性方面，菌株G1和G8完全可以滿足釀酒的需要。

耐受性測定結果表明，酵母菌G1和G8有較好的SO2、乙醇和糖耐受性，完全可以滿足枸杞酒發酵釀造的要求。

2.4 篩選酵母發酵枸杞酒的測定

分別接種菌株G1和G8于枸杞果汁中進行發酵，發酵結束后檢測枸杞酒的總糖、總酸含量、酒精度、游離SO2含量及總SO2含量，并進行感官評價，結果如表4所示。

由表4可知，與菌株G1發酵的枸杞酒相比，菌株G8發酵枸杞酒的發酵時間（7 d）短，總酸含量（10.3 g/L）少，酒精度（12.1%vol）高；兩株酵母菌發酵的枸杞酒的總糖含量、SO2含量和pH值差別不大（P＞0.05%）。菌株G8發酵的枸杞酒色、香、澄清度和口感均較好，而菌株G1發酵的枸杞酒無枸杞典型風味，且稍有苦味和雜味。結果表明，菌株G8的發酵性能優于菌株G1的發酵特性。

表4 篩選酵母發酵枸杞酒的測定結果Table 4 Determination results of wolfberry wine fermented by isolated yeasts

3 結論

本試驗從新鮮枸杞自然發酵液中篩選枸杞內生釀酒酵母菌，并對其發酵特性進行研究。通過菌落形態和細胞形態觀察，從分離的10株菌中篩選出6株酵母菌，編號為G1、G2、G3、G4、G8和G9；通過產氣性能、產酒精力和發酵力測定，篩選出菌株G1和G8為性能良好的酵母菌。耐受性測定結果表明，菌株G1和G8有較好的SO2耐受性、乙醇耐受性和糖耐受性，均可耐受250 mg/L SO2，分別可耐受乙醇含量16%vol、14%vol，耐受糖含量250 g/L、300 g/L，完全可以滿足枸杞酒發酵釀造的要求；發酵指標測定結果顯示，菌株G8發酵時間短（7 d）、發酵酒精度高（12.1%vol）、總酸含量低（10.3 g/L），發酵的枸杞酒香氣濃郁、具有枸杞典型風味，發酵性能優于G1。G8為篩選出的發酵性能優良的枸杞內生釀酒酵母。本研究對優化枸杞酒發酵工藝、改善枸杞酒風味，提高枸杞酒品質具有重要意義。