坎地沙坦對脂多糖刺激巨噬細胞炎癥因子釋放的影響

艾文偉 張明 雷夢覺 胡杰 孟哲 高登峰

江西省人民醫院二部1心內二科，2心內一科（南昌330006）；3西安交通大學第二附屬醫院心內科（西安710004）

過去的二十年中，越來越多的研究表明：慢性炎癥在動脈粥樣硬化發病過程中起到了舉足輕重的作用；炎性細胞富集、炎癥因子釋放和脂質氧化堆積均伴隨炎癥反應的發生［1-2］。巨噬細胞以及由巨噬細胞吞噬脂質形成的泡沫細胞在斑塊內聚集是包括人類在內的哺乳動物血管內粥樣斑塊的主要病理改變［3］。因此，減少巨噬細胞的遷入和泡沫細胞的生成將明顯減緩粥樣斑塊的形成。

Toll樣受體是一組高度保守的病原模式識別受體，其對免疫和炎癥反應具有多樣的調節作用，因此在天然免疫過程中起到關鍵作用，而Toll受體4（TLR4）是這一家族的重要成員之一［4］。TLR4主要分布于包括巨噬細胞、樹突狀細胞及T細胞在的內多種免疫細胞［5］；當其與內毒素（LPS）等特異性配體結合后，可上調NF-κB（p65）等轉錄因子，增加多種炎癥因子的表達，從而誘發炎癥反應［6-8］。在動脈粥樣硬化等多種疾病中，血管、心臟等靶器官內TLR4的表達明顯增加，提示以TLR4主導的天然免疫過程可能部分參與了上述病變的發展過程［9］?？驳厣程故桥R床常用的AT1受體拮抗劑，臨床用于治療高血壓［10］、糖尿病腎?。?1］以及慢性心功能衰竭［12］。已有研究提示坎地沙坦可抑制LPS誘導的腦及脾臟炎癥反應［13-14］；減少斑塊面積［15］。本研究旨在探尋坎地沙坦對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子釋放的影響及機制，以期拓展改善動脈粥樣硬化進程的細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑坎地沙坦（日本Wako公司），RPMI1640完全培養液（美國Gibco公司），胎牛血清（北京transgen公司）及real-time RT-PCR試劑盒（北京transgen公司），四氮唑藍（MTT）和內毒素（LPS）（美國Sigma公司），TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒（美國BioSource International公司），兔抗鼠TLR4、髓樣分化因子88（Myd88）、NF-κB（p65）和β-actin抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）。

1.2 巨噬細胞培養小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞株購于中科院上海細胞庫，培養于完全RPMI1640培養液中，含12%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）。37℃下置于5%CO2培養箱中，傳代至4～6代后進行試驗。

1.3 實驗分組將細胞分為5組：對照組、LPS干預組、LPS+坎地沙坦10-7mol/L、LPS+坎地沙坦10-6mol/L和LPS+坎地沙坦10-5mol/L。LPS的濃度為500 ng/mL。

1.4 細胞活性測定采用MTT比色法測定細胞活性［16］。

1.5 實時定量PCR檢測TLR4、MyD88和NF-κB（p65）mRNA的表達按4×105個/孔將細胞接種于6孔板，含血清培養基培養至70%～80%融合，無血清培養基孵育12 h。不同濃度坎地沙坦無血清培養基孵育1 h后，加入LPS（500 ng/mL）刺激4 h，用Trizol試劑（北京Transgen公司）提取各組總RNA。逆轉錄試劑盒（Transgen公司，北京）將其反轉錄為cDNA。

1.6 免疫印跡檢測TLR4、MyD88和NF-κB（p65）蛋白的表達細胞接種于6孔板培養至80%～90%融合。換用無血清培養基12 h。后以不同濃度坎地沙坦孵育1 h，加入LPS刺激9 h，RIPA細胞裂解液提取總蛋白。10%SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉膜儀轉膜?；瘜W發光法檢測條帶，Quantity one軟件行圖像分析。

1.7 ELISA測定白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平細胞接種于96孔板，不同濃度坎地沙坦孵育1 h，加入LPS刺激24 h，收集各孔中上清液。ELISA試劑盒測定IL-1β和TNF-α濃度。自動酶聯免疫吸附儀在450 nm處讀取吸光度值，繪制標準曲線，據此計算各組定IL-1β和TNF-α濃度。

1.8 統計學方法所有統計學分析均應用SPSS 19.0軟件進行，結果采用均數±標準差表示，組間比較使用單因素方差分析，多重均數比較使用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 坎地沙坦對細胞活性的影響見表1，濃度在10-8～10-4mol/L范圍內時，坎地沙坦對RAW264.7細胞活性無顯著影響。因此，后續實驗中選用10-7～10-5mol/L濃度的坎地沙坦進行進一步干預實驗。

2.2 坎地沙坦對 TLR4、MyD88及 NF-κB（p65）mRNA表達的影響LPS刺激4 h后，可明顯上調TLR4、MyD88及NF-κB（p65）的mRNA表達。坎地沙坦預處理1 h后，再給予相同濃度LPS刺激，與LPS刺激組比較，TLR4、MyD88和NF-κB（p65）的mRNA表達呈現劑量依賴性降低（圖1）。提示坎地沙坦可有效抑制TLR4炎癥通路的激活。

2.3 坎地沙坦對TLR4、MyD88及NF-κB（p65）蛋白表達的影響500 ng/mL LPS刺激9 h后，TLR4、MyD88和NF-κB（p65）的蛋白表達明顯上升?？驳厣程诡A處理1 h后，再給予相同濃度LPS刺激9 h，TLR4、MyD88和NF-κB（p65）的蛋白表達較LPS組明顯下降，并呈劑量依賴性（圖2）。提示坎地沙坦可抑制TLR4通路相關因子蛋白表達。

2.4 坎地沙坦對IL-1β和TNF-α分泌的影響LPS刺激24 h后，細胞上清液中IL-1β和TNF-α分泌明顯增加。不同濃度坎地沙坦預處理可呈劑量依賴性降低IL-1β和TNF-α濃度（圖3）。

圖1 坎地沙坦對RAW264.7細胞TLR4、MyD88及NF-κB（p65）mRNA表達的影響Fig.1 Effects of candesartan on the mRNA expression of TLR4，MyD88 and NF-κB（p65）in LPS-stimulated RAW264.7 cells

圖2 坎地沙坦對RAW264.7細胞TLR4、MyD88及NF-κB（p65）蛋白表達的影響Fig.2 Effects of candesartan on the protein expression of TLR4，MyD88 and NF-κB（p65）in LPS-stimulated RAW264.7 cells

圖3 坎地沙坦對IL-1β和TNF-α分泌的影響Fig.3 Effects of candesartan on the expression of IL-1β and TNF-α in LPS-stimulated RAW264.7 cells

3 討論

研究表明，Toll樣受體可調控天然免疫、抗原呈遞和獲得性免疫等多個免疫和炎癥環節，而這些作用主要是通過控制細胞因子表達得以實現的［6］。目前已經發現10余個Toll樣受體家族成員，均可通過與TIR結構域接頭分子（TIRAP）/Myd88結合，將外源性信號傳入胞內，從而促進細胞因子、趨化因子及膜表面分子的合成［17］。TLRs參與了粥樣硬化斑塊發生、成熟和最終破裂的各個發展階段，通過多重效應促進斑塊的形成和易損性［18-20］。與配體結合后，TLRs可通過Myd88依賴的信號傳導通路誘導NF-κB核轉位，繼而上調IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達；亦可能通過非Myd88依賴的信號轉導通路誘導干擾素調節因子3（IRF3）發生核轉位，從而增加干擾素分泌。上述途徑在促進斑塊的形成和易損性中起重要作用［21］。研究表明，人及動物模型的粥樣斑塊組織內TLR4的表達明顯升高［19］；高脂飲食的TLR4基因敲除小鼠動脈粥樣斑塊體積顯著減?。煌瑫r穩定性增強［22］。提示TLR4及其下游通路的激活是粥樣硬化疾病進展的一個重要促進因素。

本研究重點聚焦于TLR4及其下游通路的激活，及由此引發的炎癥因子釋放和炎癥反應的擴大。在給與單核細胞LPS刺激后，TLR4/Myd88 mRNA水平明顯升高，NF-κB（p65）合成增加。NF-κB由P65和P50二聚體組成，活化的NF-κB隨即從胞漿向核內轉位，與DNA上的靶向序列結合，進而調節下游多個因子的活化。因此NF-κB二聚體的激活已被認為是炎癥反應的關鍵通路之一［23］。本研究發現，給予巨噬細胞LPS刺激后，TLR4及Myd88表達明顯增加；伴隨NF-κB（p65）合成增加，下游IL-1β和TNF-α的分泌顯著升高。以上結果說明Myd88依賴性TLR4信號通路的激活參與了LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子分泌的過程。

血管緊張素Ⅱ1型受體阻滯劑（ARB）類藥物被廣泛用于原發性高血壓、糖尿病腎病及慢性心功能不全等疾病［11-13］。多項試驗證實：ARB類藥物通過抑制氧化應激反應和改善內皮功能等機制，能夠有效地減輕高糖誘發的心肌炎癥反應［24］，抑制內膜增生和減少平滑肌增殖等［25］。慢性心功能不全和高血壓患者接受坎地沙坦治療一段時間后，其血漿中C反應蛋白、白介素-6（IL-6）及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子水平明顯下降［25］。坎地沙坦能夠有效抑制LPS誘發的小鼠腎上腺炎癥反應［15］；通過降低TLR4通路激活，調節天然免疫減輕LPS引起的小鼠脾臟炎癥反應［27］。本研究中坎地沙坦可以有效降低巨噬細胞TLR4表達；抑制Myd88依賴性TLR4通路的激活；減少NF-κB依賴性炎癥因子的釋放。巨噬細胞在粥樣硬化發病過程中的重要作用早已被學術界廣泛認同，而TLR4又在巨噬細胞膜表面高表達。因此，筆者推測坎地沙坦通過對巨噬細胞TLR4炎癥通路的抑制，應該能夠起到延緩粥樣斑塊形成的作用。本研究能為坎地沙坦在粥樣硬化疾病治療方面的應用提供一定的依據。