膿毒癥合并急性腎損傷患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平及臨床意義

崔文娟 李亞紅 胡國鑫 劉健 張志坤 牟林 彭錦 陳巖 樊曉光 喬魯軍

東營市勝利油田中心醫院重癥醫學科（山東東營257000）

膿毒癥是一種由感染引起的嚴重威脅生命健康的臨床綜合征，約占重癥醫學科（ICU）患者的40%，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥的常見并發癥，而膿毒癥中約40%的患者可發展成膿毒癥合并急性腎損傷（sepsis induced acute kidney injury，SIAKI），SIAKI病死率高達70%，且發病機制較為復雜，患者預后不良［1］。有研究［2-3］發現Toll受體4（TLR4）所啟動的炎癥信號通路在SIAKI發揮重要作用，而高遷移率族蛋白box-1（HMGB1）是一種促炎因子，參與膿毒癥疾病發展的過程，同時乳脂球表皮生長因子-8（MFG-E8）是一種抗炎因子，與多種疾病發生發展過程有關，尤其與炎癥、損傷性疾病關系密切，最近有研究發現采用MFG-E8治療敗血癥引起的腎損傷能夠減輕腎組織損傷，可作為SIAKI治療的潛在藥物。而HMGB1能夠通過與TLR4結合激活MAPK、NFκB等信號通路，促進炎癥因子生成，放大炎癥級聯效應，脂多糖能刺激巨噬細胞釋放大量HMGB1，HMGB1可抑制巨噬細胞吞噬作用，而MFG-E8由巨噬細胞合成分泌，能夠強化巨噬細胞吞噬作用，減少病理損傷，減輕炎癥反應［4］。因此，本研究旨在探討SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年6月至2017年8月本院ICU收治的110例膿毒癥患者進行研究，其中膿毒癥合并急性腎損傷50例（SIAKI組），膿毒癥不伴急性腎損傷60例（非AKI組），同時選取同期健康體檢正常者50例（對照組）。納入標準：（1）符合膿毒癥診斷標準［5］以及 AKI診斷標準［6］；（2）年齡＞18歲；（3）所有受試者自愿參與本研究，并簽署知情同意書；（4）經本院倫理委員會批準。排除標準：（1）非膿毒癥引起的AKI患者；（2）合并慢性腎病及腎功能障礙者；（3）合并尿毒癥者（4）無尿患者；（5）長期服用免疫抑制類藥物者；（6）合并惡性腫瘤者；（7）孕婦或哺乳期婦女。SIAKI組男28例，女22例；年齡23～72歲，平均（57.13±9.26）歲；非AKI組男 38例，女22例；年齡24～74歲，平均（59.35±9.49）歲；對照組男 36例，女24例；年齡23～74歲，平均（58.82±9.82）歲；3組受試者性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 樣本采集所有受試者入院24 h內清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL于離心管中，室溫靜置15 min，3 200 r/min離心10 min，吸取上層血清，置于-80℃冷凍保存待測。

1.3 檢測方法（1）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測外周血 TLR4、HMGB1、MFG-E8 水平，TLR4、MFG-E8試劑盒購自美國R＆D公司，HMGB1試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書執行。（2）臨床指標檢測：全自動生化分析儀檢測外周血中降鈣素原（PCT）、血紅蛋白（Hb）、C反應蛋白（CRP）、血肌酐、尿素、尿酸、腎小球濾過率（eGFR）、清蛋白變化情況，并記錄；（3）計算急性生理學與慢性健康情況評分系統Ⅱ（APACHEⅡ）：記錄入院24 h APACHEⅡ評分，最高分為評分最終值。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用描述，兩組間比較采用t檢驗；多組間變量比較采用單因素方差分析；采用pearson進行相關性分析；采用Logistic回歸分析對影響SIAKI嚴重程度因素進行分析，當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同分組外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平比較SIAKI組、非AKI組患者外周血TLR4、HMGB1表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），且SIAKI組高于非AKI組（P＜0.05），SIAKI組、非AKI組患者外周血MFG-E8表達水平低于對照組（P＜0.05），SIAKI組低于非AKI組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同分組受試者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of TLR4，HMGB1 and MFGE8 in peripheral blood of different groups of subjects x±s

2.2 不同分組受試者臨床指標比較SIAKI組患者CRP、PCT、血肌酐、尿素、尿酸及APACHEⅡ評分顯著高于非AKI組（P＜0.05），eGFR明顯低于非AKI組（P＜0.05），兩組Hb、清蛋白比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同分組受試者臨床指標比較Tab.2 Comparison of clinical indicators in different groups of subjects x±s

2.3 SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平與臨床指標相關性SIAKI患者外周血TLR4水平與尿素、尿酸無相關性（P＞0.05），與CRP、PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評分呈明顯正相關（P＜0.05）；HMGB1水平與尿素、尿酸無相關性（P＞0.05），與 CRP、PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評分呈正相關（P＜0.05）；MFG-E8表達水平與CRP、尿素、尿酸無相關性（P＞0.05），與PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評分呈負相關（P＜0.05）。見表3。

表3 SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平與臨床指標相關性Tab.3 The correlation between the expression levels of TLR4，HMGB1 and MFG-E8 in peripheral blood of SIAKI patients and clinical indicators

2.4 Logistic回歸分析Logistic回歸分析結果顯示，CRP、PCT、血肌酐、eGFR、TLR4、HMGB1是SIAKI的危險因素（P＜0.05），MFG-E8是SIAKI保護因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

膿毒癥可引起全身嚴重炎癥反應，可發展為嚴重膿毒癥或膿毒癥休克，是AKI的主要病因，有研究［7］顯示，膿毒癥發病率以每年1.5%速度增長，預測至2020年，全球嚴重膿毒癥患者人數可增至到110萬例，而SIAKI患者將增至45萬例。SIAKI可加重患者其他器官損傷，引起多器官功能障礙綜合征發生，但目前臨床上還無SIAKI特效治療方法，且治療預后不良，因此，尋找SIAKI治療靶點及潛在生物標記物具有重要臨床意義。

表4 影響SIAKI嚴重程度的Logistic回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of SIAKI severity

TLR4是Toll樣受體家族（TLRs）重要成員之一，TLRs介導的信號通路是連接固有免疫與獲得性免疫的橋梁。有研究［8］顯示，由細菌引起膿毒癥中革蘭氏陰性菌占45%～60%，而革蘭陰性菌細胞壁毒性成分脂多糖與下游蛋白結合的復合物能夠激活TLR4復合物受體，引起一系列炎癥反應，轉錄和釋放大量細胞因子及炎性介質，在介導膿毒癥炎癥反應中發揮重要作用。研究［9］發現膿毒癥患者外周血TLR4表達水平升高，并與膿毒癥嚴重程度相關。本研究結果顯示，SIAKI組、非AKI組患者外周血TLR4表達水平高于對照組，且SIAKI組高于非AKI組。說明SIAKI患者存在外周血TLR4表達水平普遍升高現象。HMGB1是多種疾病的晚期炎性遞質，可使免疫活性細胞過表達促進多種致炎因子釋放，加重機體炎癥反應，與免疫性疾病、膿毒癥、心肌缺血、急性肺損傷等疾病的發生密切相關［10］。安曙光等［11］研究表明SIAKI患者在發病24 h內血清HMGB1表示水平明顯升高，且與SIAKI預后密切相關。本研究結果顯示，SIAKI組、非AKI組患者外周血HMGB1表達水平高于對照組，且SIAKI組高于非AKI組，這上述研究結果相似。表明SIAKI患者存在外周血HMGB1高表達現象。MFG-E8是一種糖蛋白，在多種組織器官中均有表達，具有凋亡清除作用，可在巨噬細胞與凋亡細胞間發揮橋梁作用，維持機體免疫穩態，MFG-E8同時還有修復損傷組織，減輕炎癥反應作用。AZIZ等［12］研究表明通過直接脂多糖滴注建立的小鼠膿毒癥合并急性肺損傷模型中MFG-E8表達量顯著下調。本研究結果顯示，SIAKI組、非AKI組患者外周血MFG-E8表達水平低于對照組，SIAKI組低于非AKI組，表明SIAKI患者存在MFG-E8表達水平降低現象，即免疫調節失調現象。通過臨床指標檢測發現，SIAKI組患者CRP、PCT、血肌酐、尿素、尿酸及APACHEⅡ評分顯著高于非AKI組，eGFR明顯低于非AKI組，說明SIAKI患者存在嚴重的炎癥反應及腎組織損傷現象。CRP是炎性標記物，能夠激活巨噬細胞誘導釋放多種炎癥細胞因子，加重炎癥反應，而血肌酐是腎損傷的檢測的重要指標，APACHEⅡ評分是目前全球范圍內ICU廣泛應用的疾病嚴重程度評分系統，可直接反應患者疾病的嚴重程度。經相關性分析顯示，SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1水平與CRP、PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評分呈明顯正相關，MFG-E8表達水平與PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評分呈負相關，說明TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平與SIAKI患者炎癥反應及嚴重程度關系密切。可能是由于TLR4的免疫細胞激活誘導炎性細胞釋放炎癥因子，直接或間接加重腎損傷，而HMGB1釋放入血后能夠與TLR4的復合物受體結合進一步加重腎損傷程度，同時HMGB1還能增加腎缺血-再灌注損傷，促進腎小管細胞凋亡及加重嚴重反應的作用，而MFG-E8在正常情況下發揮維持免疫穩態作用，而SIAKI嚴重的炎癥反應和腎損傷使MFG-E8水平降低，破壞了機體免疫平衡，患者出現免疫紊亂，也可加重患者腎損傷［13］。通過Logistic回歸分析顯示，CRP、PCT、血肌酐、eGFR、TLR4、HMGB1是影響SIAKI嚴重程度的危險因素（P＜0.05），MFG-E8是影響SIAKI嚴重程度的保護因素，表明臨床可通過對外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平檢測鑒別SIAKI嚴重程度。

綜上所述，本研究通過對SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達水平檢測發現，SIAKI患者普遍存在外周血TLR4、HMGB1水平升高，MFG-E8水平降低現象，且與腎功能指標具有一定相關性，并與SIAKI嚴重程度有關，可能參與SIAKI病程發生發展的過程，同時可作為SIAKI疾病嚴重程度的檢測指標。