離子液體酶法微波輔助提取山楂有機酸工藝優化及成分分析

封易成，牟德華

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000）

山楂屬于薔薇科（Rosaceae），它在歐洲和中國已經成為預防和治療心臟病的多效傳統藥物[1-3]。追溯到20世紀初，山楂被用于改善血液循環，并治療失眠[4-6]。在英國，山楂用于心肌功能障礙，高血壓和動脈粥樣硬化[7]。其果實在中國用于治療血液循環障礙[8]。山楂果實，葉子和花的提取物可以預防高血壓和心力衰竭等疾病[9-10]。山楂的水提取物具有降血脂、抗炎和血液流變學的改善等多種功能[11-13]。植物性果實中的有機酸在預防飲食引起的慢性疾病（骨質疏松癥，肥胖）方面發揮重要作用[14-15]。

離子液體（ionic liquid，ILs）被定義為有機鹽，由大分子有機陽離子和有機或無機陰離子組成[16]。離子液體具有許多獨特的性質，如化學穩定性、熱穩定性、不可燃性、高導電性，并且表現出對各種化合物良好的溶解性[17-20]。實際上，離子液體被認為是“綠色”溶劑的原因在于離子液體的揮發性非常低，可以避免大氣污染[21]。使用離子液體比使用普通有機溶劑的一個明顯的優點是離子液體的極性、疏水性、黏度和溶劑混溶性可以有效的通過改變陽離子、陰離子和連接的取代基進行調整[22-23，17]。離子液體作為綠色溶劑，在環境友好型和回收利用方面具有無可替代的優勢和潛力，非常適用于對安全性要求較高的醫藥和食品行業[24]。

微波輔助提取在食品方面的應用之前也有所報道。微波輔助提取是一種有前景且有效的技術，可在更短的時間內保證更高的產量[25-26]。微波使得細胞破裂，從而有利于提取溶劑進入以溶解目標化合物，可以更快的提取并防止目標化合物的降解[27]。

本文采用了一種使用離子液體酶法微波輔助提取山楂有機酸的新技術，旨在探索一種綠色、便捷提取有機酸，同時對其分子結構造成最小可能損害的方法。試驗條件使用響應面法進行了優化。最后，將這種方法與其他提取方法的結果進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂來自河北省承德興隆縣，為新鮮的鐵山楂，篩選直徑范圍為2.3 cm～2.8 cm，每個鮮果質量為9.3 g～11.3 g 之間，平均含水率為74.6%。

纖維素酶（酶活≥400 U/mg）、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸氫二鹽（1-Butyl-3-methylimidazolium hydrogen phosphate di-salt [Bmim]H2PO4）、溴化 1-丁基-3-甲基咪唑（1-Butyl-3-methylimidazolium bromide [Bmim]Br）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸鹽（1-Butyl-3-methylimidazolium sulfate [Bmim]2SO4）、溴化 1-己基-3-甲基咪唑（1-Hydroxy-3-methylimidazolium bromide [Hmim]Br）、氯化 1-己基-3-甲基咪唑（1-Hexyl-3-methyl imidazole chloride [Hmim]Cl）、溴化1-乙基-3-甲基咪唑（1-Bromo-3-methylimidazolium bromide [Emim]Br）：上海寶曼生物科技有限公司；沒食子酸、丁二酸、DL-蘋有機酸：天津市大茂化學試劑廠；磷酸二氫銨：天津市精細化工有限公司；檸檬酸、酒石酸：天津市永大化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：天津星馬克科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

MICHEM ME6-TC 微波樣品處理平臺：北京盈安美誠科學儀器有限公司；LC-20AT SHIMADZU 高效液相色譜儀：日本島津公司；Adventurer 分析電子天平：美國奧豪斯儀器有限公司；78-1 型磁力攪拌器：江蘇大地自動化儀器廠；VaCo2 冷凍干燥機：德國ZIRBUS有限公司；HC-200 型華晨高速多功能粉碎機：浙江省永康市金穗機械制造廠。

1.3 方法

1.3.1 山楂粉的制備

使用冷凍干燥機將去核山楂冷凍干燥，用粉碎機打碎，過40 目篩，得到山楂粉，放于干燥器中備用。

1.3.2 浸泡法提取山楂有機酸

山楂有機酸的浸泡提取法參照《中國藥典》（一部）[28]，稱取山楂細粉1 g，加入去離子水100 mL，室溫浸泡4 h，時時振搖，濾過，量取濾液25 mL，加去離子水50 mL，加酚酞指示液2 滴，用0.1 mol/LNaOH 滴定，每 1 mL NaOH 滴定液相當于 6.404 g 枸櫞酸（C6H8O7），含有機酸按枸櫞酸計。

1.3.3 離子液體酶法微波輔助制取山楂有機酸

稱取2 g 山楂粉于圓底燒瓶中，加入纖維素酶和離子液體水溶液混勻，置于微波樣品處理平臺中提取9 min，離心得上清液，取1 mL 上清液，加去離子水20 mL，用0.1mol/LNaOH 滴定，計算有機酸含量。

1.3.4 單因素試驗

單因素試驗各因素水平設置如下：離子液體[Bmim]H2PO4、[Bmim]Br、[Bmim]2SO4、[Emim]Br、[Hmim]Br、[Hmim]Cl；離子液體濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L；纖維素酶添加量為樣品質量的0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%；液料比為 15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），反應溫度為 35、45、55、65、75 ℃；提取時間為 10、15、20、25、30、35 min。分別考察上述 5個因素對山楂有機酸含量的影響。

1.3.5 提取工藝優化

在單因素試驗結果的基礎上，采用響應面分析法，利用Box-Behnken 試驗原理，以離子液體添加量、纖維素酶添加量、液料比及提取時間為變量，有機酸含量為響應值，選用二次回歸方程，進行有機酸提取工藝條件的優化，見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded and actual values for the factors used in response surface analysis

1.3.6 有機酸組分的液相色譜測定

液相色譜條件：選用迪馬Platisil ODS C18[4.6×250 mm ID，5 μm]色譜柱，0.02 mol/L NaH2PO4（pH2.9）∶乙腈（98∶2，體積比）緩沖溶液為流動相，控制流速為0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長213 nm，進樣量20 μL。用草酸、酒石酸、L-蘋有機酸、抗壞血酸、檸檬酸、沒食子酸的標準品做標準曲線，將測定樣品的色譜峰與標準曲線進行比對計算其含量。

1.4 統計學分析

用SPSS 24.0 軟件進行統計分析，組間數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），所得數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 離子液體種類對有機酸含量的影響

離子液體的種類對提取效果影響較大，為了尋找最佳的離子液體，研究了6 種不同陰離子和碳鏈長度作為陽離子的離子液體，因為有機酸大部分為水溶性化合物，所以選取的6 種離子液體均為親水性。離子液體種類對山楂有機酸含量的影響見圖1。

圖1 離子液體種類對山楂有機酸含量的影響Fig.1 Effects of ionic liquids on hawthorn acid content

如圖1所示，取同樣濃度的不同陰陽離子的離子液體提取山楂中的有機酸時，用[Bmim]Br 提取得到的有機酸含量最高，且具有顯著性，離子液體的親脂性隨著烷基鏈長度的增加而增加，[Bmim]+為短鏈陽離子，親水性強，[Bmim]Br 具有很高的溶解纖維素的能力，溶解了植物細胞的壁，這有助于有機酸的提取[29]。這一現象可能和 [Bmim]Br 與有機酸之間的氫鍵有關[30]。所以選取[Bmim]Br 作為提取劑用于進一步提取研究。

2.1.2 離子液體濃度對有機酸含量的影響

離子液體濃度對有機酸含量的影響結果見圖2。

圖2 離子液體濃度對山楂有機酸含量的影響Fig.2 Effect of ionic liquid concentration on hawthorn acid content

提取有機酸含量隨著離子液體濃度增加而增加，到0.04 mol/L 時含量達到最高。這是因為離子液體可以溶解更多的植物纖維并促進溶液進入細胞[31]。同時，離子液體的微波吸收能力和傳輸能力通過增加其濃度而增強[32-33]。離子液體具有較強的催化活性，在與酶結合提取植物有機酸時，酶活性都比其在有機溶劑中高[34]，此外，高濃度離子液體穿透細胞壁的能力增強，從而提高了提取能力[35]。適當的離子液體添加能夠增強纖維素酶的催化活性，但當離子液體添加量過大時，[Bmim]Br 濃度越大，黏度越大，[Bmim]Br 更難以穿透樣品基質，阻礙了纖維素酶與底物的結合，從而影響到纖維素酶的催化作用，降低酶解速率[36，18]。從圖2中可以看出，當離子液體濃度為0.04 mol/L 時，目標分析物的含量最高。考慮到提取率和經濟節能，選擇0.04 mol/L[Bmim]Br 作進一步試驗。

2.1.3 提取溫度對有機酸含量的影響

不同提取溫度對有機酸含量的影響，試驗結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對山楂有機酸含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on hawthorn acid content

隨著提取溫度升高到55 ℃，提取有機酸含量增加，隨著溫度繼續升高，有機酸提取含量呈現先降低后升高的趨勢，然后隨著溫度的升高有機酸出現降低后再次升高的趨勢。這是由于纖維素酶在較高溫度下逐漸失活，而隨著溫度的升高，細胞壁在高溫下遭到破壞，同時高溫有利于降低離子液體的粘度，提高離子液體的擴散能力和溶解性，從而使提取得到的有機酸含量升高[37]。為了使有機酸不受高溫破壞同時降低耗能，選擇55 ℃的提取溫度用于進一步分析。

2.1.4 纖維素添加量對有機酸含量的影響

纖維素添加量對有機酸含量的影響，結果如圖4所示。

山楂中的有機酸存在于在細胞內，提取的過程實際是有效成分溶解并擴散到溶劑中的過程，提取過程的阻力來源于細胞壁、固液界面和流體膜，為了提高提取效率采用破壞細胞壁的方法，有效降低提取過程的阻力。細胞壁中的纖維素分子是由D-葡萄糖殘基通過β-（1，4）糖苷鍵聚合而成的，它不溶于一般的水和有機溶劑，當纖維素酶破壞β-（1，4）糖苷鍵，可將細胞壁中的纖維素分子酶解成小分子或水溶性物質，從而使山楂中的有機酸釋放，提高提取效率[38]。當纖維素酶添加量在0.2%～1%時，山楂有機酸含量隨著加酶量的增加而增加，當纖維素酶添加量為1%時有機酸含量達到最高值152.399 mg/g，此時纖維素酶的添加量已能夠將山楂細胞壁破壞完全，添加過量的纖維素酶對提高含量沒有很大的影響。

2.1.5 液料比對有機酸含量的影響

液料比對有機酸含量的影響見圖5。

圖4 纖維素酶添加量對山楂有機酸含量影響Fig.4 Effect of cellulase addition on hawthorn acid content

圖5 液料比對山楂有機酸含量的影響Fig.5 Effect of liquid ratio on hawthorn acid content

當液料比從 15∶1（mL/g）變為 30∶1（mL/g）時，提取收率提高。可能是因為離子液體促進微波能量的傳輸，促進了有機酸的有效溶解。當液料比大于30∶1（mL/g）時，可能由于纖維素酶遭到稀釋，含量較低，從而降低了有機酸的提取含量。當采用響應面優化提取條件時，使用 25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）液料比進一步分析。

2.1.6 提取時間對有機酸含量的影響

為了評估時間對提取的影響，用不同的提取時間進行了一系列的試驗。提取時間對有機酸含量的影響結果見圖6。

圖6中的結果表明提取產量隨著提取時間的增加而增加。延長提取時間有優點和缺點。一方面細胞結構破壞，有利于有機酸的溶解。另一方面，熱敏性物質被破壞，并且生物活性也下降[39]。從圖6可以看出，隨著提取時間的延長，有機酸提取含量升高，到25 min時達到提取含量最高點。與傳統水浸泡法相比，離子液體酶法有效的縮短了提取時間。在進一步的單因素試驗中用25 min 作為提取時間。當優化提取條件時，20、25 和30 min 的提取時間用于進一步分析。

圖6 提取時間對山楂有機酸含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on hawthorn fruit acid content

2.2 響應面優化試驗設計及結果

2.2.1 Box-Behnken 試驗設計及結果

以離子液體濃度、纖維素酶添加量、液料比、提取時間為自變量，以有機酸含量為響應值，響應面試驗分析及結果如表2所示。

表2 響應面試驗分析及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續表2 響應面試驗分析及結果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型方程的建立及顯著性檢驗

采用Design-Expert 軟件對表2所得的有機酸含量試驗數據進行回歸擬合，如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic regression model for extraction yield

由表3得到A 離子液體濃度、B 液料比、C 纖維素酶添加量、D 時間為自變量對有機酸含量的回歸方程：有機酸含量=163.93-1.73A-0.53B+1.75C+0.36D-0.75AB-1.05AC-1.48AD+0.35BC+0.82BD+0.32CD-7.65A2-5.11B2-7.92C2-4.39D2。

通過回歸模型的方差分析表得出，整體模型的P值為0.021 7 小于0.05，表明二次模型顯著，失擬項P值為0.296 06 大于0.05，不顯著，表明此二項模型擬合有效，可以分析和預測各因素與響應值的關系。各影響因素的主次順序為：C 纖維素酶添加量＞A 離子液體添加量＞B 液料比＞D 時間。

2.2.3 各因素的響應面分析

為了說明離子液體添加量（A），液料比（B），纖維素酶添加量（C）和提取時間（D）和之間的相互作用，繪制了響應面的三維圖像，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用。根據回歸方程得出不同因素的響應面分析圖及相應等高線圖結果見圖7。

各因素交互作用對山楂有機酸含量的影響，若曲線越陡峭，則表明該因素對有機酸含量的影響越大，相應表現為響應值變化的大小[40]。而由等高線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。從表3回歸分析結果可以看出，纖維素酶含量對有機酸含量影響最大。

2.3 最佳試驗條件預測與驗證

由Design-Expert 軟件可求得回歸方程的極值點，得到有機酸提取最佳工藝條件為：離子液體溴化-1-丁基三甲基咪唑濃度為0.039 mol/L、纖維素酶添加量質量分數 1.059%、液料比 29.84∶1（mL/g）、提取溫度55 ℃、提取時間25.3min，在此條件下有機酸的理論預測含量為164.159 mg/g。對最佳提取條件進行驗證試驗，考慮到實際操作，將最佳工藝參數修正為：離子液體濃度為0.039mol/L、纖維素酶添加量質量分數1.06%、液料比 30∶1（mL/g）、提取溫度 55 ℃、提取時間 25 min。測得有機酸含量為161.863 mL/g，與預測值接近。

圖7 兩因素交互作用對山楂有機酸含量的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of ramsaric acid content by two-factor interactions

2.4 有機酸提取物的高效液相色譜分析結果

按最佳試驗條件對兩種提取方式得到的有機酸化學成分進行測定分析，定性結果及相對含量見表4。

表4 山楂有機酸中主要成分及含量Table 4 Hawthorn organic acids in the main components and content

由表4可以看出，由傳統水浸泡法和離子液體酶法兩種方法提取的山楂有機酸成分相同，采用兩種方法提取有機酸，其中檸檬酸含量最高，分別占總有機酸的88.641%和90.858%；其次含量較高的為酒石酸，分別占測得有機酸的6.313%和4.959%；含量最少的為沒食子酸。從提取的主要成分及相對含量上來看，兩種提取方法并沒有很大的區別，但離子液體酶法微波輔助提取可以破壞山楂細胞壁，使山楂有機酸更容易被提取出來，減少了一些熱敏性成分的破壞，使得提取得到相對含量有所提高。

兩種提取方法得到的有機酸主要成分均為檸檬酸，PENGZHAN LIU 等[41]測定22個品種山楂中有機酸的主要成分均為檸檬酸，占總酸含量的55%～82%。Baoru Yang 等[42]測定的10個品種山楂中有機酸的主要成分也均為檸檬酸。有機酸含量也可能影響果實中酚類化合物的穩定性和漿果對健康的促進作用，糖分含量和糖酸比的不同也會引起品種和品種間感官特性和生理效應的差異[43]。

3 結論

本研究以山楂為原料，采用響應面試驗設計對離子液體酶法微波輔助提取有機酸的工藝進行優化，最佳提取條件為：離子液體溴化-1-丁基三甲基咪唑濃度為0.039 mol/L、纖維素酶添加量質量分數1.059%、液料比 29.84∶1（mL/g）、提取溫度 55 ℃、提取時間25.3 min，在此條件下有機酸含量為164.159 mg/g。離子液體酶法微波輔助提取有機酸的方法與傳統水浸泡法相比，縮短了提取時間，提高了提取山楂有機酸的含量，但含量最高的成分均為檸檬酸。

本文提出了一種從山楂果實中提取有機酸的有效方法，并提出了一種離子液體酶法微波輔助提取山楂有機酸的新技術，希望這種技術在深入的研究之后更廣泛的應用于醫藥及食品行業中。