基于COⅠ基因的中國及鄰近海域部分笛鯛屬魚類DNA條形碼研究

唐楚林，肖 林，章 群，周 琪，徐 示，王業磷

（暨南大學生態系，廣州 510632）

笛鯛屬（Lutjanus）魚類（下文簡稱笛鯛）隸屬鱸形目 （Perciformes）笛鯛科 （Lutjanidae），據Fishbase（http：／／www.fishbase.org／）記載該屬魚類全世界約有67種，中國南海有20多種［1］。笛鯛主要分布在世界熱帶及亞熱帶海域珊瑚礁或紅樹林生境，是產地名貴經濟魚類，并具有重要生態服務功能。但近年來，一方面受珊瑚礁和紅樹林被人為破壞和環境污染影響，其棲息地縮小退化［2］；另一方面因其肉質鮮美、經濟價值高且具有產卵集群現象而遭受過度捕撈，笛鯛資源現狀不容樂觀［3］。

準確的物種鑒定是開展海洋生態調查和魚類資源養護措施制訂的前提。由于傳統的笛鯛分類主要基于外部形態計測特征和體表斑點條紋特征，不僅高度依賴分類專家個人經驗，同時也易受不同發育階段影響，如形態上笛鯛仔魚表現出與鮨科（Serranidae）和石鱸科（Haemulidae）等在珊瑚礁生息的其它科魚類類似的形態特征；不同物種間外部形態特征部分重疊，條紋斑點較為類似且不同發育階段有變化，采集后會褪色［4］，因而需要突破表型分類的局限，建立更有效的笛鯛分類鑒定方法。

DNA條形碼［5］通過對一段標準目的基因DNA序列進行PCR擴增和測序分析進行物種鑒定，不受外部形態特征和個體發育階段的影響。2003年HERBERT等［6］對13 320個物種的 COⅠ基因分析發現，多數物種種內遺傳距離小于1%，很少大于2%，遺傳距離種間接近或大于種內10倍；2005年 WARD等［7］對澳洲207種魚類的研究表明，絕大部分魚類都能被COⅠ基因部分序列有效區分。對鳥類、昆蟲等［8-9］越來越多的研究表明，基于COⅠ基因的DNA條形碼在動物分類、物種鑒定、隱存種的發掘等方面都具有極其廣泛的應用。

目前國內外對于笛鯛的研究主要集中在生理生態［10］和分子系統學研究方面［11-13］，DNA條形碼僅有VICTOR等［14］鑒定不同發育階段的巴西笛鯛（L.cyanopterus），王中鐸等［1］測序分析國內3省5個地點13種笛鯛13個標本等少數報道。上述研究雖解決了部分笛鯛的分類問題，但僅局限于少數種類與地點。本研究測定了中國沿海19個地點11種笛鯛73個COⅠ基因部分序列，并結合從GenBank下載中國及鄰近海域69條同源序列，旨在明確部分種類的分類地位，豐富和補充中國笛鯛屬魚類的COⅠ基因DNA條形碼數據庫，為種質資源的養護調查提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分子實驗

本研究測定的勒氏笛鯛（L.russelli）、金焰笛鯛（L.fulviflamma）、奧氏笛鯛（L.ophuysenii）、約氏笛鯛（L.johni）、藍點笛鯛（L.rivulatus）、五線笛鯛 （L.quinquelineatus）、紫 紅 笛 鯛 （L.argentimaculatus）、千年笛鯛（L.sebae）、紅鰭笛鯛（L.erythopterus）、馬拉巴笛鯛（L.malabaricus）和黃笛鯛（L.lutjanus）等中國11種笛鯛73尾為2004年4月—2014年8月取自中國沿海19個地點，并置于95%乙醇中固定保存，依據Fishbase并參照《中國魚類系統檢索》和《南海魚類志》進行形態鑒定。樣品采集情況和下載的序列信息見表1。

表1 測定或下載的笛鯛屬魚類信息Tab.1 Details of sequenced and downloaded sequences of Lutjanus

·續表1·

取100 mg魚背肌肉晾干后，參考樂小亮等［15］改進的酚／氯仿法提取總DNA。使用本實驗室自行設計的引物：COⅠF：5′-TGTAAAAC GACGGCCAGTCCTGTGGCAATYACDCGCTGAT，COⅠR：5′-CAGGAAACAGCTATGACNACYTCNG GRTGNCCRAAGAA，采用30μL的 PCR反應體系［16］：上下游引物 （10μmol·L-1）各0.3μL，10×PCR緩沖液 （含1.5 mmol·L-1MgCl2）3μL，BSA和 dNTPs（2 mmol·L-1）各1.2μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.5μL，DNA模板 1μL，加ddH2O補充至終體積30μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min。將條帶清晰明亮的擴增產物送往北京六合華大基因公司切膠純化，并于ABI-3730自動測序儀上進行測序。

1.2 數據處理

利用Clustal W軟件對測定的序列進行人工校對后，與下載的序列合并，經MEGA7.0軟件計算堿基組成、變異位點、簡約位點以及轉換／顛換的比值，基于Kimura 2-parameter模型（即 K2P）計算種間和種內遺傳距離，構建鄰接樹（neighborjoining tree），并以自舉檢測（bootstraps）1000次獲得支持率［17］，同時采用自動條形碼間隙檢索方法（automatic barcode gap discovery，ABGD）進行假設種分析［18］。

2 結果與分析

截取652 bp的標準條形碼序列區［5-7］，發現在142條序列中沒有堿基插入和缺失；共有223個變異位點，其中210個簡約信息位點。堿基T、C、A、G的平均含量分別為 28.1%、28.5%、24.6%和18.8%，A＋T含量（52.7%）高于 G＋C含量（47.3%），表現出了堿基組成偏倚性，該結果與COⅠ基因堿基組成中普遍存在的AT含量高于GC含量的特征一致［7］。轉換與顛換比（R）為3.94，表明堿基突變尚未達到飽和，適合系統發育分析［19］。

基于K2P模型的18種笛鯛的種間和種內遺傳距離見表2。結果表明，平均遺傳距離種間與種內分別為14.92%和0.55%，種間平均遺傳距離是種內的27倍，符合HEBERT［6］提出的10倍種間／種內遺傳分歧比的參考標準。種內遺傳距離除畫眉笛鯛（L.vitta）（2.5%）外，其余均小于2%的種內閾值。種間遺傳距離除藍點笛鯛和星點笛鯛（L.stellatus）間為2.1%、紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛間僅有0.3%外，其余物種在4.1% ～21.7%。

在鄰接樹上，18種笛鯛形成了18個分支（圖1），平均遺傳距離分支間 14.4% （2.9% ～21.8%）約為分支內 0.17%（0～0.6%）的 85倍（圖2），與ABGD分析結果一致（圖3）：當種內先驗遺傳距離為0.77%～2.15%時，笛鯛屬被分成了18個假設種。18種笛鯛中10種笛鯛獨立成支，根據遺傳距離種內≤2%，種間≥種內10倍標準［6］，支持其物種有效性。另外，勒氏笛鯛進一步分成2個支持率為100%的小支：一支與印度笛鯛（L.indicus）THA1和 THA8混雜在 Clade 1，另一支在Clade 2獨立成支；紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛聚合在Clade 18上；GenBank下載的畫眉笛鯛TW1、星點笛鯛TW1和TW2分別與本實驗形態鑒定并測序的奧氏笛鯛和藍點笛鯛混雜在同一分支上（Clade 6和Clade16）。

圖1 基于線粒體COⅠ基因序列的18種笛鯛鄰接樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on mtDNA COⅠsequences of 18 Lutjanus species

圖2 18種笛鯛分支間（左）與分支內（右）遺傳距離Fig.2 Histogram of genetic distance between（left）and within（right）clades

圖3 笛鯛屬魚類的ABGD分析圖Fig.3 Automatic barcode gap discovery analyses of Lutjanus注：橫坐標表示先驗種內分化值，縱坐標表示劃分類群的數量Note：Abscissa means prior intraspecific divergence，ordinate means the number of groups produced

3 討論

3.1 紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛分類地位的探討

雖然紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛體色均為紅色，體側無任何縱帶，側線上方鱗片均斜向后背緣排列，可數性狀重疊等形態特征較為相似，但又并不完全相同，如前者側線下方鱗片均與體軸呈斜行排列，后者側線下方鱗片則與體軸平行排列，并且魚尾柄上有黑色鞍狀斑且鑲以珍珠似的白色邊緣［11］。在鄰接樹上二者聚為一支，分支內遺傳距離（0.3%）和種間遺傳距離（0.3%）均在一般物種的種內遺傳范圍（≤2%）內。譚圍等［13］也得到類似結果。

這種形態有一定差異但分子上卻非常接近的情況，在其它物種中也曾有過報道，如柳淑芬等［20］發現棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）和黑鰓梅童魚（C.niveatus）雖形態有差異，但種間遺傳距離僅為0.4%，推斷尚未達到物種分化的程度。宮亞運等［21］發現黑斑緋鯉（Upeneus tragula）和馬六甲鯡鯉（U.moluccensis）間遺傳距離僅有0.3%，但可從體側縱帶和背鰭顏色進行區分，認為可能是近期輻射進化導致的。由此可見，紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛可能仍屬同一物種，或近期分化的不同物種。另外，由于同屬物種種間雜交情況并不鮮見，雜交后代形態上可能傾向于其中一親本或雙親的中間形態，而線粒體呈母系遺傳方式，導致分子與形態鑒定不一致的情況出現，故不能排除種間雜交的可能。

3.2 其它笛鯛分類地位的探討

1）勒氏笛鯛分為2個100%支持率的小支Clade 1和Clade 2，小支間平均遺傳距離（2.9%）是小支內（0.5%）的 5.8倍，種內遺傳距離1.3%，推測2個小支可能仍屬于同一個物種，但其準確的物種分類地位尚待研究。

2）下載序列星點笛鯛 Lutset TW1和 Lutset TW2與本研究測定序列藍點笛鯛混雜在Clade 16上，前者種內遺傳距離為1.8%，并未達到種的分化水平；且二者的種間遺傳距離為2.1%，表明二者可能隸屬同一物種，或是沒有完成譜系揀選的近期形成的物種，當然也不排除種間雜交或前者錯誤鑒定的可能。

3）因無法對下載序列進行形態鑒定，對部分類群的分類地位在此僅作如下推測：

①下載的印度笛鯛序列Lutind THA1和Lutind THA8與本實驗測序的勒氏笛鯛聚在Clade 1上，分支內遺傳距離為0，屬種內差異；其余印度笛鯛獨立成支。由于印度笛鯛和勒氏笛鯛的外部形態特征較為相似，可能因發育階段的不同而出現特征重合，推測二者出現混雜可能是魚類鑒定有誤。

②下載的畫眉笛鯛序列Lutvit TW1與奧氏笛鯛聚合在Clade 6上，其余的畫眉笛鯛占據了Clade 7，分支間遺傳距離（6.6%）是分支內遺傳距離 0.3%（0.1% ～0.5%）的 22倍，滿足HERBERT等［9-10］提出的“10 ×法則”，但畫眉笛鯛2個分支間的遺傳距離為2.5%，超過種內遺傳距離一般小于2%的閾值。從外部形態上看，奧氏笛鯛體側縱帶上有一暗色橢圓大斑，而畫眉笛鯛并不具該特征，表明下載的畫眉笛鯛序列Lutvit TW1可能隸屬奧氏笛鯛。

綜上所述，基于COⅠ基因的DNA條形碼技術能夠對笛鯛屬絕大部分魚類進行有效的區分，說明線粒體COⅠ基因作為笛鯛屬DNA分類條形碼是可行的，但仍存在一定的局限性，如紅鰭笛鯛和馬拉巴笛鯛，可能受到錯誤鑒定、種間雜交或者近期分化等多種因素的影響而出現了聚類在同一分支上的情況，僅進行線粒體COⅠ基因分析不能很好地區分。另外，本研究未能獲取中國笛鯛全部報道的物種。因此，在今后的工作中仍需補充其它物種，同時結合形態測量、核基因標記以及生物學研究，以進一步明確中國笛鯛的分類地位。