基于線粒體控制區的中國近海棘頭梅童魚群體遺傳結構研究

梁述章，宋 煒，馬春艷，蔣科技，

張鳳英1，趙 明1，馬凌波1

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部遠洋與極地漁業創新重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

棘頭梅童魚（Collichthys lucidus），屬鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaenidae），梅童魚屬，為短距離洄游的淺海魚類，喜棲息在河口咸淡水交匯處，生長速度快，適溫、適鹽范圍廣［1-4］。其肉質細嫩可口，沿海居民喜食此魚，而目前市場銷售的棘頭梅童魚數量有限，價格居高，無法滿足市場需求［5］。近幾年中國水產科學研究院東海水產研究所研究團隊加大了棘頭梅童魚人工繁育和馴養技術的攻關力度，取得了可喜的成果。而對棘頭梅童魚遺傳結構的認識，也是該物種保護和合理利用的重要內容。

魚類線粒體DNA（mt DNA）與其它許多脊椎動物的mt DNA一樣，結構簡單，母系遺傳，幾乎不發生重組，進化速度快，是魚類分子群體遺傳學和分子系統學理想的分子標記［6-8］。控制區（D-loop區）是mt DNA上的一段非編碼區，在mt DNA上，D-loop區的進化速度最快，較適合用于種群遺傳結構分析和系統發育分析［9-10］。目前，僅見鄭德峰等［11］和殷麗娜［12］利用線粒體控制區對棘頭梅童魚的遺傳特征和遺傳分化進行了初步分析，為更好地認識我國沿海棘頭梅童魚群體遺傳結構現狀，本研究利用線粒體D-loop區對棘頭梅童魚7個不同地理群體的遺傳多樣性進行評價，以期為棘頭梅童魚資源的保護和利用提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚分別采集于江蘇連云港、江蘇大豐、上海崇明、浙江舟山、浙江溫州、福建寧德和福建廈門海域（圖1）。樣品采集地點、時間、數量和體長等信息見表1。

1.2 DNA提取、擴增及測序

圖1 樣本采集地點Fig.1 Map of the sampling locations注：LYG：Lianyungang；DF：Dafeng；CM：Chongming；ZS：Zhoushan；WZ：Wenzhou；ND：Ningde；XM：XiamenNote：LYG：Lianyungang；DF：Dafeng；CM：Chongming；ZS：Zhoushan；WZ：Wenzhou；ND：Ningde；XM：Xiamen

樣本冰凍保存運輸至實驗室進行肌肉組織取樣，用于DNA提取。采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京，天根生化科技），以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，分光光度計檢測其濃度和純度。線粒體D-loop區域的引物序列為 AAATCCTTGAATAACACCGC（DL-F）和 ATCACTGCTGAGTTCCCTTG（DL-R），由上海杰李生物技術有限公司合成。PCR反應體系為25μL：模板 DNA 1μL、酵母 PCR Mix 12.5μL、上下游引物各1μL，加雙蒸水至總體積25μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性25 s，58℃退火50 s，72℃延伸90 s，共40個循環；72℃最后延伸10 min；4℃保存。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海杰李生物技術有限公司正反雙向測序。

1.3 數據分析

序列經拼接后，于 NCBI數據庫中進行BLAST同源檢測，利用Clustal X軟件對序列進行比對排序與校正；MEGA 5.1軟件用以統計群體的突變位點數、突變類型及核苷酸組成，計算群體內和群體間的遺傳距離［13］；用 DnaSP 5.1軟件確定序列的單倍型數、單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及平均核苷酸差異數等參數［14］；基于Kimura雙參數模型構建群體間單倍型的NJ樹，可靠性經 1000次重復抽樣檢驗［15-16］；應用Arlequin 3.1軟件的分子方差分析（AMOVA）進行群體間的遺傳變異評估，通過1000次重抽樣來檢查不同遺傳結構水平上協方差的顯著性［17］。采用分化固定指數Fst來評價兩兩群體間的遺傳差異，通過1000次重抽樣來檢查兩兩群體間的Fst顯著性，通過 Fst值計算基因流 Nm［18］。采用Network軟件構建單倍型網絡圖，檢測單倍型間的進化關系，并進行中性檢驗和錯配分析，推測種群的平衡狀態以及種群事件時間［19］。

表1 棘頭梅童魚采樣信息Tab.1 Sampling details of C.lucidus

2 結果與分析

2.1 D-loop區序列分析

PCR擴增產物經測序及序列比對得到795 bp的D-loop基因序列，7個群體的線粒體控制區堿基組成基本一致，A、T、C、G平均含量分別為31.04%、31.43%、23.99%和 13.54%，A＋T含量（62.47%）明顯高于 G＋C含量（37.53%），與大多數脊椎動物線粒體DNA的堿基組成相似，體現出顯著的AT堿基偏好性［20］。208條序列共檢測到66個變異位點，存在4個插入／缺失現象，轉換顛換比 K嘌呤＝4.99，K嘧啶＝7.813，整體 R＝2.845。

2.2 遺傳多樣性分析

7個群體共檢測到83種單倍型，未發現所有群體的共享單倍型，每個群體均有獨享單倍型，其中CM群體最多，有17個獨享單倍型（表2）。CM、LYG、DF和 ZS群體之間存在共享單倍型Hap1，占所有個體的22.12%，WZ、ND和 XM群體之間存在兩個優勢單倍型Hap45和Hap47，共占整體的23.08%。從單倍型分布可以看出7個群體之間存在地理上的分化現象。

群體的遺傳多樣性參數見表3。單倍型參數方面，CM和WZ群體的單倍型數目及單倍型多樣性較高，分別為20（0.954 00±0.000 67）和19（0.948 00±0.000 77），XM群體的單倍型數目和單倍型多樣性最低，僅為 7（0.554 00±0.009 98）。核苷酸參數方面，DF群體的核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數最高，分別為0.007 08和5.621，XM群體最低，分別為0.001 83和1.448。由以上結果可見，CM、WZ和DF群體遺傳多樣性高，而XM群體的遺傳多樣性最低。

表2 棘頭梅童魚7個群體單倍型分布情況Tab.2 Distribution of haplotypes among 7 populations of Collichthys lucidus

·續表·

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2.3 群體遺傳結構

棘頭梅童魚不同群體內遺傳距離在0.002～0.007之間，其中DF群體的內部遺傳距離最大，XM群體內部遺傳距離最小（表4）。兩兩群體間的遺傳距離在0.004～0.039的范圍內，LYG、DF、CM和ZS 4個群體之間的遺傳距離及WZ、ND和XM 3個群體之間的遺傳距離較小，在0.004～0.007之間，而兩組群體間的遺傳距離在0.036～0.039之間，說明7個棘頭梅童魚群體之間明顯分為兩支，即北方群體（LYG、DF、CM和ZS）和南方群體（WZ、ND和XM）。

7個棘頭梅童魚群體間遺傳分化結果如表4所示，兩兩群體的遺傳分化系數 Fst值在-0.008 72～0.928 28之間。DF和 LYG群體的Fst值為 -0.008 72，遺傳分化程度極低；CM、ZS群體和DF、LYG群體兩兩之間的Fst值屬于中度遺傳分化；ND、WZ和XM群體之間的Fst值均在0.05之內，屬于低度遺傳分化；DF、LYG、CM和ZS群體與其它3個群體間的Fst值均大于0.8，說明兩組地理群體間遺傳結構存在顯著的差異。

基于Fst值計算出群體間的基因流Nm，LYG、DF、CM和ZS群體兩兩之間的Nm值均大于1，與其它3個群體的Nm值極小；WZ、ND和XM群體兩兩之間的結果一致（表5）。

上述結果作為依據，將7個棘頭梅童魚群體分為2組，進行遺傳差異的分子方差分析。總的方差分為組間方差組分（Va）、組內群體間方差組分（Vb）和群體內方差組分（Vc），如表6所示，組間變異為85.97%，組內群體間變異占0.68%，群體內變異為 13.35%，遺傳分化指數 Fst＝0.866 47（P＝0）。

表3 棘頭梅童魚D-loop區遺傳多樣性參數Tab.3 Genetic diversity parameters of mt DNA D-loop region in Collichthys lucidus

表4 棘頭梅童魚群體內遺傳距離（對角線，粗體）及兩兩群體間遺傳距離（對角線上）和遺傳分化系數（F st）（對角線下）Tab.4 Pairwise genetic distances within population（diagonal，bold），and genetic distance（above diagonal），fixation index（F st）（below diagonal）between every two populations of Collichthys lucidus

表5 棘頭梅童魚群體間的基因流Tab.5 Gene flow value between populations of Collichthys lucidus

表6 棘頭梅童魚群體間遺傳差異分子方差分析Tab.6 Analysis of molecular variance（AMOVA）of populations of Collichthys lucidus

2.4 單倍型鄰接關系樹和簡約網絡圖

為了更直觀地闡述群體間的遺傳結構，以中介鄰接網絡法構建了棘頭梅童魚單倍型網絡圖（圖2），單倍型被分為3部分，其中兩部分分別以Hap1和Hap47為中心呈典型的星狀分布態勢逐級拓展，另一部分作為過渡單倍型存在。Hap1存在于LYG、DF、CM和 ZS群體中，Hap47存在于WZ、ND和XM群體中。

圖2 基于D-loop區構建棘頭梅童魚單倍型網絡關系圖Fig.2 Haplotype network diagram constructed based on D-loop region of Collichthys lucidus注：連云港：粉色；大豐：黃色；崇明：藍色；舟山：綠色；寧德：紫色；溫州：黑色；廈門：白色Note：LYG：Pink；DF：Yellow；CM：Blue；ZS：Green；ND：Purple；WZ：Black；XM：White

以單倍型構建鄰接關系樹，大部分節點分支的支持率均大于50%，具有顯著的地理譜系結構（圖3）。鄰近關系樹中大致分為兩個區域，結合表2可知，區域1的單倍型基本出現在LYG、DF、CM和ZS群體中；區域2的單倍型基本出現在WZ、ND和XM群體中，有少數ZS群體個體出現。單倍型鄰接關系樹和單倍型簡約網絡圖將7個棘頭梅童魚群體分為2個地理群體，與遺傳距離分析和Fst值所得結論一致。

2.5 中性檢驗和錯配分析

棘頭梅童魚群體中性檢驗包括Tajima’s D和 Fu’s Fs分析，如表3所示，Tajima’s D的檢測結果均為負值，ZS和ND群體顯著，其余群體不顯著；Fu’s Fs檢驗結果中，除DF為正值外，其它均為負值，且僅ND群體顯著。上述結果表明，各個群體，尤其是ND和ZS群體，符合中性模型，選擇壓力小，可能經歷了種群的規模性擴張或定向選擇。錯配分析結果如表7所示，整體的SSD值為0.161 42（P＞0.05），各個群體的值在 0.005 29～0.658 15之間，Rag整體值為0.040 71（P＞0.05），說明棘頭梅童魚仍處于膨脹階段，為棘頭梅童魚種群擴張提供了證據。

3 討論

棘頭梅童魚廣泛分布于中國沿海，且以黃海、東海為主。本研究選取連云港、大豐（黃海），崇明、舟山、溫州、寧德和廈門（東海）7個地理群體的208個樣本，利用線粒體控制區（D-loop）對棘頭梅童魚遺傳多樣性進行分析。

圖3 基于Kimura 2-Parameter模型構建單倍型的NJ樹Fig.3 NJ clustering diagram of haplotypes constructed based on Kimura 2-Parameter model

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，是物種生存與進化的基礎，其中核苷酸多樣性是分析群體遺傳多樣性的重要指標，與單倍型多樣性共同反映線粒體DNA的變異程度［21］。本研究7個群體共發現83種單倍型，其中70種獨享單倍型，分布于各個群體，無所有群體共享的優勢單倍型，這與殷麗娜［12］研究結果相似，棘頭梅童魚的短距離洄游特性是造成無共享單倍型、多獨享單倍型的主要原因。7個群體的總體遺傳多樣性高（h＝0.913，π＝0.014 11），且核苷酸多樣性與平均核苷酸差異數呈現一致的變化趨勢，說明中國沿海的棘頭梅童魚遺傳資源豐富，對環境的適應能力及進化潛力大。7個群體中，XM群體的遺傳多樣性最低（h＝0.554，π＝0.001 83），根據 GRANT等［22］對海水魚類遺傳多樣性劃分的分布模式，判斷XM群體接近第一種模式（低h低π），說明XM群體近期出現過種群瓶頸效應或種群由單一、少數系群所發生的奠基者效應形成，導致其遺傳多樣性偏低。其余群體均符合第二種模式（高h低π）特點，說明群體受到了環境變化的影響，經歷了快速的擴張期，種群數量急劇增加，堿基的突變導致單倍型數量和單倍型多樣性的增加，而核苷酸多樣性沒有獲得足夠的時間積累。Tajima’s D、Fs中性檢驗以及錯配分析結果也證明了棘頭梅童魚經歷了群體擴張，根據擴張參數τ和（3%～10%）／百萬年的D-loop區進化速率推算［12］，中國沿海棘頭梅童魚的群體擴張發生在3.87～12.9萬年前。

遺傳距離是衡量群體間和群體內部遺傳關系的重要指標，遺傳距離的大小反映群體間親緣關系的遠近和群體內差異程度［23-24］。本研究中群體內部的遺傳距離在0.002～0.007之間，數值高低與核苷酸多樣性參數的變化趨勢一致。遺傳距離數值將7個群體以舟山為界，明顯的分為北方群體（LYG、DF、CM、ZS）和南方群體（WZ、ND、XM），兩組地理群體間遺傳差異顯著。北方群體中，除DF群體內部遺傳距離大于其與ZS、CM和LYG群體的遺傳距離外，群體內部的遺傳距離均小于或等于兩兩群體間的遺傳距離，說明DF群體內部分化大，推測種群間出現了交叉；南方群體中，WZ和ND群體的內部遺傳距離和兩群體間遺傳距離相等，說明兩群體間也存在明顯的交叉現象。遺傳分化系數Fst是衡量群體間遺傳分化程度的標準［25］，本研究的Fst結果與遺傳距離結果相呼應，均說明中國沿海棘頭梅童魚的遺傳結構出現明顯的地理區域性，即南北分化格局現象，DF和LYG群體、ND和WZ群體的Fst均為負值，同樣驗證兩兩群體間存在明顯的交叉現象。WZ、ND和XM群體與北方群體的Fst值均大于0.82，且呈現地理位置上由北向南Fst值逐漸增加的趨勢，XM群體最大，其與北方群體的Fst差值大于0.9，此結果與殷麗娜［12］得出的結果一致，表明棘頭梅童魚在南北分化的基礎上，北方群體與南方群體地理距離越遠，基因交流逐漸趨于0，分化程度越高。

表7 棘頭梅童魚7個群體的錯配分析參數Tab.7 Mismatch distribution analysis for 7 Collichthys lucidus populations

基于以上南北分化結果，計算群體的基因流Nm，并進行AMOVA分析。Nm值越大，說明群體間的基因交流水平越高［26］。本研究中，南、北地理群體間的Nm＜0.1，地理群體內部Nm＞2，根據WRIGHT［27］對 Nm值的劃分，認為南、北地理群體之間的基因交流極弱，可能由于遺傳漂變發生了分化；南、北地理群體內部存在較強的基因流，群體間的遺傳分化較小。其中，DF和LYG群體、ND和WZ群體間的基因流是南北類群內部基因流的10倍以上，進一步驗證遺傳距離中關于其種群間交叉的結論。AMOVA分析中，組間變異為85.97%，組內群體間變異占0.68%，群體內變異為13.35%，遺傳分化指數 Fst＝0.866 47（P＝0），說明主要的遺傳變異來自于南、北兩個地理群體間，群體內部也出現了一定程度的分化。基因流Nm和AMOVA分析進一步證實中國沿海棘頭梅童魚形成明顯的南北分化格局。

為了更直觀地表述棘頭梅童魚群體間的遺傳結構，以單倍型為依據，構建鄰接關系樹和網絡關系圖。鄰接關系樹中，83種單倍型被分為兩部分，結合單倍型分布情況可以看出，兩部分分別代表南方地理群體和北方地理群體（表2）。棘頭梅童魚7個群體中存在3種優勢單倍型，Hap1（北方群體）、Hap45和Hap47（南方群體），分別在南、北地理群體中適應環境變化，穩定存在。網絡關系圖分為主要的兩部分，分別以Hap1和Hap47為中心呈星狀分布態勢拓展，兩者結果相符。

以上結果均表明棘頭梅童魚存在明顯的南北分化格局。趙明等［28］、殷麗娜等［12］和鄭德峰等［29］分別利用 COI、D-loop和 AFLP分析棘頭梅童魚遺傳結構，同樣推斷我國棘頭梅童魚存在南北分化格局；宋煒等［5］和梁述章等［30］分別利用核基因微衛星和形態框架數據分析，未發現南北分化現象。分析方法、采集樣本時間、地點、數量、樣本生長狀況和分析方法等的不同應該是造成以上不同結論的主要原因。形態參數極易受到環境和樣本生長時期的影響，線粒體分子標記由于母系遺傳，易受到選擇壓力的影響，核基因對種群遺傳結構的檢測更敏感［31］。棘頭梅童魚南北分化格局產生的原因大致可歸納為以下4點：1）洋流影響：舟山是臺灣暖流、日本寒流以及黃海冷流的交匯點，舟山以北主要受黃海冷流和日本寒流的影響，舟山以南受臺灣暖流的影響；2）在趙明等［28］、謝起浪等［32］的研究中，均發現溫州群體存在過度捕撈現象，一定程度上阻止了溫州及其以南海域的棘頭梅童魚前來舟山漁場覓食、產卵等；3）棘頭梅童魚是短距離洄游種，使群體間產生基因交流，又極大程度限制基因交流的強度；4）根據擴張參數推算棘頭梅童魚群體擴張時間在3.87～12.9萬年前，即更新世冰期，海平面下降導致邊緣海地區的物種種群分化且產生地理隔離。