結直腸癌中KRAS、NRAS基因突變與臨床病理特征的關系

潘理會 李育莊 李春輝

(承德醫學院 1血流變學與分子細胞學研究室，河北 承德 0670000；2附屬醫院病理科)

研究報道結直腸癌(CRC)的發生、發展與表皮生長因子受體(EGFR)介導的信號傳導通路EGFR/大鼠肉瘤(RAS)/鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)的調控密切相關〔1〕，近年一些靶向EGFR的單抗藥物已成功應用于CRC的臨床治療，取得良好療效，但抗EGFR單抗藥物的有效性受其下游RAS基因〔包括大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、大鼠肉瘤病毒轉化基因(NRAS)〕類型的影響，對RAS野生型攜帶者療效顯著，對RAS突變型患者療效不佳。目前檢測KRAS和NRAS基因突變狀態已成為眾多專家學者研究腫瘤靶基因治療的熱點課題，本文采用實時熒光定量PCR檢測KRAS、NRAS基因在CRC組織中的表達情況，并結合臨床病理參數探討二者在CRC發生、發展中的作用機制。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2012年12月至2015年5月間承德醫學院附屬醫院行手術切除的CRC蠟塊標本238例。所選標本均有完整的臨床病歷及病理資料，且術前均未接受任何化療及抗腫瘤藥物治療。

1.2DNA提取 將CRC石蠟包埋組織連續切片4 μm厚1～2張，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯鏡下觀察形態，標記腫瘤細胞比例達70%以上的標本。將做好標記的標本連續切片8～10 μm厚5～6張，常規脫蠟、水化處理，刮取腫瘤組織于EP管內，按照試劑盒說明書步驟提取DNA，應用紫外分光光度計測定提取DNA的質量和濃度，A260/A280在1.7～2.1之間為符合標準。

1.3實時熒光定量PCR擴增 采用PCRTaqMan探針技術檢測標本中KRAS、NRAS基因的突變情況，嚴格按照檢測試劑盒說明書進行操作。反應體系包括模板50 ng、正反向引物各25 pmol、Master Mix及TaqMan標記探針，總反應體系各為50 μl。反應條件分3步：第1步：42℃ 5 min，95℃ 5 min，1個循環；第2步：95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15個循環；第3步：93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31個循環，第3階段60℃收集信號，進行實時熒光定量PCR。每次實驗均設定突變的陰、陽性及空白對照孔。

1.4結果判讀 以無模板對照擴增曲線的最高點為準設定閾值，沒出現擴增曲線或Ct≥28.0的標本為陰性標本；出現擴增曲線且Ct≤26.0的標本為陽性標本；26.0

1.5試劑與儀器 石蠟組織DNA提取試劑盒及人KRAS、NRAS基因突變檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫藥科技有限公司；實時熒光定量PCR儀購自杭州赫貝科技有限公司。

1.6統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行χ2檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1KRAS基因突變情況及與臨床病理特征的關系 86例(36.1%)KRAS基因突變，隨著淋巴結遠處轉移和Duke分期的增高KRAS突變率明顯增加(P<0.05)，在其他臨床病理特征的組間差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2NRAS基因突變情況及與臨床病理特征的關系 11例(4.6%)NRAS基因突變。NRAS突變率在各臨床病理特征的組間差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3CRC組織中KRAS與NRA基因突變的相關性 未檢測到KRAS與NRAS同時突變者，表明二者突變相互排斥，相關分析顯示，KRAS與NRAS 突變沒有明顯相關性 (r=0.782，P=0.058)。

表1 CRC組織中KRAS基因突變與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

表2 CRC組織中NRAS基因突變與臨床病理特征的關系

3 討 論

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，與配體結合后激活刺激其介導的下游信號傳導通路膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳遞途徑(RAS/RAF/MAPK)發生級聯反應，導致細胞異常增殖、轉移，發生癌變〔1〕。抗EGFR單抗可通過拮抗其與配體的結合，阻止其活化，進而阻斷其下游信號通路的傳導，從而發揮抗瘤作用。KRAS與NRAS基因是EGFR通路下游調控因子RAS家族的重要成員，二者中任何一種發生突變都可不通過EGFR活化刺激而直接激活EGFR通路引發癌變。國外文獻報道在CRC中KRAS突變率為30%～55%，主要發生在2外顯子12和13密碼子上；NRAS突變率為1%～6%，主要發生在3外顯子61密碼子上〔2,3〕。國內研究報道CRC中KRAS突變率為43.8%,NRAS突變率較低為1.9%〔4〕。也有報道CRC中KRAS突變率為42.57%，NRAS突變率為3.96%〔5〕。本研究與國內外報道的基本相符，同時本研究數據顯示KRAS突變率明顯高于NRAS，KRAS突變在CRC中是常見的生物學事件，可能是CRC發病的主要機制之一，而NRAS可能不是主要機制。KRAS的突變狀態可作為臨床選用抗 EGFR單抗藥物的重要參考指標，而NRAS突變狀態的預測價值還在探討中。研究表明，對CRC患者行單一檢測KRAS基因是不夠的，還要聯合檢測NRAS基因，只有聯合檢測KRAS、NRAS基因的CRC的患者才能建議使用EGFR靶向藥物治療〔6〕，所以，腫瘤組織中NRAS突變率雖然偏低，其突變狀態的檢測是不可忽視的，聯合檢測KRAS、NRAS基因突變狀況，對篩選出適應抗EGFR靶向藥物治療的患者有重要的指導價值。

目前，關于KRAS和NRAS突變狀態與CRC中臨床病理參數的關系報道無統一定論。有文獻報道，CRC中KRAS突變在有淋巴結轉移和TNM分期增加的患者中明顯增高〔7〕；CRC中KRAS突變更常見于女性和近端結腸〔8〕；CRC中NRAS突變在遠端結直腸癌突變率較高〔9〕；還有研究報道CRC患者KRAS/NRAS突變與年齡相關，≥65歲的老年患者突變率較高，而與性別、原發部位、組織學類型、分化程度、分期、區域淋巴結轉移、術后復發轉移均無關〔10,11〕。吳新新等〔12〕對147例CRC患者的KRAS和NRAS基因突變情況進行檢測，發現KRAS突變的發生更傾向于淋巴結轉移及Duke分期C期患者，與年齡、性別、腫瘤部位、組織學類型、分化程度、遠處轉移、癌結節及美國癌癥聯合會(AJCC)分期等均無關；NRAS突變與上述所有病理特征均無相關關系。代云等〔13〕對265例CRC患者的KRAS和NRAS基因突變情況進行檢測，發現二者突變與年齡相關，高齡患者突變率較高，而與性別、原發部位、組織學類型、分化程度、TNM分期、區域淋巴結轉移、遠處轉移、術后復發轉移等臨床病理特征均無關。本研究表明KRAS參與了CRC的侵襲、轉移，預示患者預后不良；KRAS突變對高危轉移患者的早期篩選和預后評估有重要參考價值，也為腫瘤的侵襲、復發機制研究提供了新的方向。上述結論各家研究，差異很大，造成這些差異的原因，可能與各家研究的樣本量、檢測方法及判讀標準不同等因素有關，有待于進一步研究探討。上述研究結果表明KRAS和NRAS雖同為一個家族成員，同為EGFR信號通路下游重要的效應因子，但在腫瘤發生、發展過程中所起的調控作用不盡相同。近年來，國內外對CRC中EGFR信號通路上KRAS/NRAS突變狀態與臨床病理參數關系的研究剛剛興起，許多認識還不夠成熟，尤其對NRAS的檢測較少且檢出率偏低，提示臨床CRC患者抗EGFR藥物治療時，應多基因聯合檢測來指導靶向藥物方案的制定。明確KRAS/NRAS與CRC病理參數的相關性，有助于闡明CRC發病機制，有助于CRC的靶基因治療。對二者突變狀態的檢測還應擴大檢測規模，采取多種研究手段，綜合論證分析。目前，關于腫瘤中KRAS和NRAS突變之間相關性的研究國內外少見報道，有資料顯示，CRC中KRAS和NRAS之間基本不存在交叉突變〔14〕，二者突變相互排斥〔15〕。本研究與上述研究結果相一致，經相關分析顯示，KRAS和NRAS之間突變沒有關聯，提示二者可能是彼此獨立的影響著CRC的進程，具體機制還需進一步研究。