牛膝有效部位含藥血清聯用對損傷軟骨細胞的增效作用

李開言 張留記 屠萬倩 劉曉苗

(1河南省中醫藥研究院，河南 鄭州 450004；2河南中醫藥大學)

骨關節炎(OA)以關節軟骨降解為特征，是危害人類健康的常見多發性疾病。懷牛膝是傳統道地藥材四大懷藥之一，具有強筋骨、補肝腎的臨床功效，是治療OA的常用中藥材。牛膝中含有活性成分多糖、甾酮、皂苷均可保護損傷的軟骨細胞，但作用機制不同。若將各活性成分按不同比例配伍作用于軟骨細胞，是否會產生增效作用需實驗證實。本實驗采用自制提取純化的牛膝多糖(ABP)和牛膝甾酮皂苷(ABTS)制備成含藥血清，按不同比例配伍后，考察對硝普鈉損傷C28/I2軟骨細胞的保護作用，探討ABP、ABTS聯合應用是否能提高受損軟骨細胞的增殖活性，起到“減毒增效”作用，為防治OA的新藥開發提供依據。

1 材料和方法

1.1材料 C28/I2細胞系：上海博全爾生物科技有限公司；懷牛膝藥材經河南省中醫藥研究院都恒青研究員鑒定為莧科植物牛膝A.bidentata Bl.的干燥根；β-蛻皮甾酮(純度≥98%，批號111638-201402)和D-無水葡萄糖(批號833-201001)，購自中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Ro(純度≥98%，批號1421)，購自上海詩丹德生物技術有限公司。

雄性SPF級SD大鼠60只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司〔許可證號SCXK(魯)20140007，NO.37009200006686〕；硝普鈉(派尼化學試劑廠，批號：20160508)；DMEM/F12培養基(博士德生物工程有限公司)；1×磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2～7.4，北京索萊寶科技有限公司)；澳洲新生胎牛血清(FBS500-S，AusGeneX)；胰蛋白酶-EDTA消化液(胰蛋白酶0.25%，EDTA 0.53 mmol/L，北京索萊寶科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1ABP及ABTS的制備 取牛膝藥材去蘆頭，搶水沖洗，60℃烘干后剪碎(黃豆大小)，按料液比1∶6加入70%乙醇，浸泡1 h，加熱回流提取2次，提取時間分別為1.5 h、1 h。收集提取液，濃縮至約1 000 ml，3 000 r/min離心30 min，殘渣用蒸餾水洗滌2次，每次20 ml，洗滌液與上清液合并。ABTS制備：上述濃縮液過大孔吸附樹脂HP-20和SP-207，水洗，棄去水洗液；5%乙醇溶液洗脫，棄去5%乙醇溶液洗脫液；80%乙醇溶液洗脫，收集80%乙醇溶液洗脫液。回收乙醇濃縮，即得ABTS；ABP制備：上述殘渣揮干乙醇，加超純水3 000 ml，浸泡1 h，加熱回流提取2次，提取時間分別為2 h、1.5 h。收集提取液，濃縮至約1 000 ml，濃縮液緩緩加入乙醇，不斷攪拌，使含醇量至25%，靜止24 h，3 000 r/min離心30 min除去沉淀，上清液繼續緩慢加入一定量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量至75%，靜止24 h，3 000 r/min離心30 min，收集沉淀物，干燥，即得ABP。

稱取一定量ABTS，甲醇溶解，β-蛻皮甾酮對照品為對照，UV242 nm測定總甾酮的含量；人參皂苷Ro對照品為對照，UV544 nm測定總皂苷的含量；稱

取一定量ABP，超純水溶解，葡萄糖對照品為對照，UV484 nm測定總多糖的含量。

1.2.2大鼠含藥血清的制備 分組：空白組、ABP組、ABTS組、ABP/ABTS生藥比(1∶1)混合物(ABP/ABTS)組，空白組30只，其余組各10只。空白組給予蒸餾水，給藥組均按 10.8 g/kg(生藥量)進行大鼠灌胃7 d，末次給藥1 h后，腹主動脈取血，分離血清，56℃滅活，分裝后-80℃保存。

1.2.3細胞鋪板數的確定 取處于對數生長期的C28/I2細胞，分別按0.15×103、0.75×103、1.50×103、7.00×103、15.00×103、22.50×103、30.00×103個/孔接種于96孔板，每組設6個復孔，5%CO2、37℃培養48 h，每孔加入20 μl 0.5%噻唑藍(MTT)溶液培養4 h，小心吸棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫避光振蕩10 min，于酶標儀570 nm處測定OD值。

1.2.4硝普鈉造模濃度的確定 C28/I2以最佳接種數于96孔板培養24 h，分別加入硝普鈉濃度0.00、0.50、0.60、0.75、0.90、1.00、1.10、1.25、1.50 mmol/L的含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基，培養24 h后分別加入20 μl 0.5% MTT，進行MTT實驗(同1.2.2)，每組6個復孔。細胞存活率(%)=OD(硝普鈉各濃度組)/OD(硝普鈉0 mmol/L組)×100%。

1.2.5ABP、ABTS給藥時間的確定 C28/I2以最佳接種數于96孔板培養24 h，分別加入不同濃度ABP、ABTS、ABP/ABTS生藥比混合物與硝普鈉共培養24、48、72 h，MTT法檢測細胞OD值。實驗分組見表1。

表1 含藥血清濃度梯度表(n=6)

1.2.6ABP/ABTS不同配比對軟骨細胞凋亡的影響 C28/I2以最佳接種數于96孔板培養24 h，分別加入各濃度的ABP/ABTS配比與硝普鈉共培養24 h，MTT法檢測細胞存活率(OD570)。實驗分組見表2。

1.3統計學方法 采用統計軟件SPSS16.0進行單因素方差、LSD-t檢驗分析。

表2 ABTS-ABP不同配比設置表(n=4)

2 結 果

2.1ABTS及ABP含量測定 如表3所示，ABP、總甾醇、總皂苷含量分別為(34.7±0.03)%、(16.8±0.03)%、(66.5±0.01)%，實驗重復性良好。

表3 有效部位總成分含量測定結果

2.2細胞鋪板數的確定 細胞數(0.15×103)個/孔、(0.75×103)個/孔、(1.50×103)個/孔、(7.50×103)個/孔、(15.00×103)個/孔、(22.50×103)個/孔、(30.00×103)個/孔時OD值分別為(0.136±0.009)、(0.268±0.009)、(0.334±0.005)、(0.642±0.014)、(0.818±0.018)、(0.826±0.025)(0.840±0.024)。C28/I2細胞鋪板(0.75×103～15×103)個/孔時，與前一鋪板數比OD值增加明顯(P<0.05,n=6)，(15×103～30×103)個/孔OD值增加不明顯(P>0.05)，推測細胞數>(15×103)個/孔時，因空間不足，細胞生長受到抑制。因此選用(15×103)個/孔作為最佳鋪板數。

2.3硝普鈉造模濃度的確定 如表4所示，硝普鈉濃度≤0.60 mmol/L時，OD值略有增加，說明低濃度的硝普鈉對細胞生長有促進作用；當硝普鈉濃度在0.75～1.50 mmol/L時，隨著硝普鈉濃度的增加OD值不斷減小，這說明較高濃度的硝普鈉對細胞有損傷作用。為能使后期加藥保護得到一個理想的結果，因此選用存活率為50%左右1.00 mmol/L作為損傷模型的硝普鈉濃度。

表4 硝普鈉造模濃度確定表

2.4ABP、ABTS給藥時間的確定 與模型組相比，培養24 h除ABP/ABTS高濃度組外，其余組OD值均顯著升高(P<0.05)；培養48 h除ABP低濃度組、ABTS中濃度組、ABP/ABTS中、高濃度組外，其余組OD值均顯著升高(P<0.05)；培養72 h，ABP/ABTS低、中濃度組、ABP低濃度組及空白組OD值顯著高于模型組(P<0.05)。考慮24 h較48、72 h各組OD值升高顯著，因此選取加入含藥血清培養24 h。見表5。

2.5ABP/ABTS不同配比對軟骨細胞凋亡的影響 如表6所示，ABP為0.10%、0.50%、1.25%的3列數據以板1相關數據為參照(空白對照組0.849 7±0.004 9)，ABP為2.50%、5.00%的2列數據以板2相關數據為參照(空白對照組1.048 7±0.118 6)。

與ABP-ABTS(0.00%-0.00%)相比，所有ABP-ABTS配比OD值均升高，但只有板1：ABP 0.00%，ABTS 1.25%、50.00%時；ABP 0.10%、0.50%，ABTS所有濃度時；ABP 1.25%，ABTS除0.10%以外濃度時；板2：ABP 0.00%,ABTS 2.50%時;ABP 5.00%,ABTS 0.50%、5.00%時差異有統計學意義(P<0.05)，說明含藥血清為0.10%時，已經可以抑制軟骨細胞的凋亡。板1中ABTS為5.00%、ABP為1.25%時OD值顯著高于空白對照(P<0.05)，推測ABP-ABTS最佳配比可能在1.25%-5.00%附近。

表5 ABP、ABST、ABP/ABST保護軟骨細胞的時效性

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表6 ABTS-ABP不同配比OD值比較

與ABP-ABTS(0.00%-0.00%)比較：1)P<0.05,2)<0.01

3 討 論

實驗證實，OA的關節軟骨存在過度軟骨細胞凋亡，這可能是OA發病機制中的重要環節〔1〕。軟骨細胞的增殖、分化及凋亡在軟骨的形成、新陳代謝及損傷修復整個過程中發揮重要的調控作用〔2〕。牛膝為四大懷藥之一，是莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根，具有逐瘀通經、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引血下行之功效。在中醫藥文獻治療OA中，牛膝用藥頻次居第2位〔3〕。牛膝中含有甾酮類、皂苷類、多糖類等多種成分〔4〕，在治療OA中均發揮重要作用。甾酮屬于雌激素，能與骨雌激素受體結合，呈現出一定的抗骨質疏松作用，人參皂苷可改善長期大劑量激素使用后的激素抵抗，增加激素的抗炎作用，又不引起激素的副作用〔5〕。甘草多糖對離體大鼠軟骨細胞增殖和糖胺聚糖合成均有促進作用〔6〕。牛膝提取物-蛻皮甾酮能夠保護脂多糖誘導的兔軟骨細胞損傷，作用與目前公認藥物硫酸軟骨素效果相當〔7〕，可能與抑制一氧化氮合酶(iNOS)表達有關。邱蕓等〔8〕發現，ABP能夠促進骨性關節炎修復，具有很好的臨床價值。馬玉環等〔9〕發現，ABP促進了軟骨細胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達。孫雪蓮等〔10〕發現，牛膝總皂苷能顯著改善兔膝OA，抑制軟骨組織退變，與提高轉化生長因子(TGF)-β1的表達有關。毛偉歡等〔11〕發現，牛膝醇溶液透入輔助治療OA患者療效佳，值得臨床推廣。楊麗萍等〔12〕發現補肝腎、強筋骨的中藥配伍對OA 的干預是多途徑多靶點的，涉及機體免疫、凋亡、細胞增殖、代謝等多個方面，是一個綜合調控的過程。本實驗采用MTT法，硝普鈉制造軟骨細胞損傷模型，用ABTS、ABP單獨作用于細胞，OD值明顯增大，細胞存活率升高，得出ABTS、ABP具有抗軟骨細胞凋亡的作用；ABTS、ABP兩兩配比，ABTS含量一定時，加入不同濃度ABP都會使OD值增大，且呈現一定的規律，提示ABTS配伍ABP能增效。實驗初期設計的按生藥比例同時灌胃ABTS和ABP，制備混合含藥血清的方法，從實驗數據來看，并沒有比兩個有效部位單獨使用更好，故有必要檢測ABTS-ABP不同配比對軟骨細胞增殖的影響，從而獲得最佳增效組合。實驗中ABTS-ABP配比為1.25%-5.00%時，存活率顯著增加，提示ABP-ABTS最佳配比1.25%-5.00%，但是這一配比經過大鼠的體內代謝，獲得的含藥血清中可能發生化學成分及含量改變，需要后期運用薄層、液質聯用等技術，對ABTS、ABP及ABTS/ABP顯著增效配比進行含藥血清的定性定量分析，為研制治療OA新藥提供科學依據。