獼猴桃根多糖調控Wnt信號通路抑制結腸癌增殖促進其凋亡

羅緒 羅麗丹 尚獻會

(1遵義醫學院附屬醫院中醫科，貴州 遵義 563000；2遵義醫藥高等專科學校；3遵義醫學院附屬醫院小兒外科)

結直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，近些年發病率呈現上升趨勢〔1〕。腫瘤細胞增殖和凋亡不平衡是其發生發展的重要因素。有效誘導腫瘤凋亡成為腫瘤治療的一個新方法。獼猴桃根具有抗癌、健胃、活血消腫等多種功效，其提取物對腫瘤具有抑制作用。研究顯示，獼猴桃根提取物可通過抑制信號傳導及轉錄激活因子(STAT)3降低肝癌進展〔2〕；獼猴桃根多糖(ACPS)可抑制胃癌細胞生長〔3〕，這提示獼猴桃根在腫瘤中有重要作用。但ACPS對結腸癌細胞生物學特性的影響還未明確。Wnt信號通路與腫瘤發生發展有密切關系，在包括結腸癌在內的多種腫瘤中過度激活〔4,5〕。研究顯示，抑制Wnt信號通路可誘導結腸癌細胞凋亡，抑制增殖〔6〕。ACPS是否可調控Wnt信號通路影響結腸癌細胞生物學特性還未明確。本研究檢測ACPS或Wnt信號通路抑制劑XAV-939對HT29細胞活力和凋亡的影響，以期為結腸癌的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 人結腸癌HT29細胞購自中國科學院上海細胞庫；β-catenin、cyclinD1、survivin抗體均購自美國CST；XAV-939購自美國Sigma-Aadrich；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)及流式細胞儀均購自美國BD；細胞計數試劑盒(CCK)8購自上海碧云天；酶標儀購自日本Hitech。

1.2CCK8檢測ACPS對HT29細胞活力的影響 將生長至對數期的HT29細胞制備成細胞懸液，并將濃度調整為5×104/ml，接種于96孔板，每孔中加入200 μl的細胞懸液，培養24 h以進行同步化處理，加入終濃度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml的ACPS，每個濃度設置3個復孔，陰性對照組中不加入藥物，空白組不加入細胞，均加入100 μl培養液，于培養24、48和72 h加入CCK8溶液，均加入100 μl，孵育2 h，在450 nm處，酶標儀測定各孔吸光度值(A值)。A值可間接反映細胞增殖能力。實驗重復3次。

1.3ACPS調控Wnt信號通路對HT29細胞活力的影響 HT29細胞分為四組，即陰性對照組、ACPS組(4.00 mg/ml的ACPS處理細胞)、XAV-939組(10 μmol/L的XAV-939處理細胞)和ACPS+XAV-939組(4.00 mg/ml的ACPS和10 μmol/L的XAV-939處理細胞)。以5×104/ml濃度接種HT29細胞于96孔板，每孔200 μl，培養24 h后按照上述分組處理細胞，于處理后48 h參照1.2方法檢測各組細胞A值。實驗重復3次。

1.4ACPS調控Wnt信號通路對HT29細胞凋亡的影響 收集按照1.3分組處理48 h的4組細胞，胰酶消化及磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，400 μl的1×結合緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，加入 5 μl Annexin V-FITC，混合均勻后避光孵育15 min，再加入PI 10 μl，混合均勻后避光孵育5 min，1 h內上機，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.5Western印跡 收集按照1.3分組處理48 h的4組細胞，加入100 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液提取總蛋白，蛋白定量后，取總蛋白等量(40 μg)，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后電轉至硝酸纖維素膜，轉好的膜用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗(β-catenin、cyclinD1、survivin及內參β-actin)，4℃過夜，加入1∶1 000稀釋的二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記〕，室溫孵育1 h，洗膜，加入電化學發光(ECL)顯色，顯影后，以β-actin為內參蛋白，通過凝膠圖像處理系統分析目的蛋白相對于β-actin蛋白的光密度值。

1.6統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1ACPS對HT29細胞活力的影響 0.25 mg/ml和0.50 mg/ml的ACPS對HT29細胞活力影響與陰性對照組比較差異無統計學意義(24 h：P>0.05)，而1.00～4.00 mg/ml的ACPS在24～72 h均能降低HT29細胞活力，與陰性對照組比較差異具有統計學意義，且具有濃度依賴性，各濃度均呈現時間依賴性。見表1。

表1 ACPS對HT29細胞活力的影響

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05

2.2ACPS調控Wnt信號通路對HT29細胞活力的影響 ACPS和XAV-939均能抑制HT29細胞活力(0.635±0.047，0.718±0.055)，與陰性對照組(1.262±0.068)比較差異具有統計學意義(P<0.05)，兩者聯合對細胞活力抑制作用更明顯(0.431±0.036)，且與ACPS和XAV-939組細胞活力比較差異均具有統計學意義(F=135.422，P=0.000)。

2.3ACPS調控Wnt信號通路對HT29細胞凋亡的影響 ACPS和XAV-939均能誘導HT29細胞凋亡(13.44%±0.39%、10.12%±0.31%)，與陰性對照組(2.31%±0.16%)比較差異具有統計學意義(P<0.05)，兩者聯合對細胞凋亡的誘導作用更明顯(18.85%±0.54%)，且與ACPS和XAV-939組細胞凋亡率比較差異均具有統計學意義(F=1 016.887，P=0.000)。見圖1。

圖1 ACPS調控Wnt信號通路對HT29細胞活力的影響

2.4ACPS對Wnt信號通路相關蛋白表達的影響 ACPS和XAV-939均能抑制β-catenin、cyclinD1和survivin蛋白表達，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，兩者聯合對β-catenin、cyclinD1和survivin蛋白表達抑制作用更明顯，且與ACPS和XAV-939組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 ACPS對Wnt信號通路相關蛋白表達的影響

組別β-catenincyclinD1survivin陰性對照組0.741±0.0580.321±0.0350.198±0.023ACPS組0.256±0.0281)2)0.156±0.0181)2)0.085±0.0101)2)XAV-939組0.339±0.0341)2)0.204±0.0211)2)0.119±0.0141)2)ACPS+XAV-939組0.134±0.0150.097±0.0110.031±0.006F值149.95051.31468.194P值0.0000.0000.000

3 討 論

我國中藥資源比較豐富，中藥中有效活性成分在結腸癌治療中發揮重要作用。如黃芪多糖、靈芝多糖均可抑制結腸癌細胞增殖，誘導凋亡〔7,8〕。獼猴桃根為獼猴桃科植物獼猴桃的根或根皮，目前已證實從根莖中提取的多糖復合物或多糖、三萜類化合物等具有多種生物活性，且在一些地區用于抗癌的佐劑。如獼猴桃根三萜類化合物及ACPS均可抑制胃癌增殖和促進凋亡〔9〕。本研究結果與Song等〔3〕研究ACPS對胃癌細胞增殖影響的趨勢是一致的。ACPS對結腸癌發生發展的影響可能是通過抑制癌細胞增殖和誘導凋亡。

Wnt信號通路異常激活與結直腸癌、肺癌等多種腫瘤發生發展密切相關，分為經典Wnt信號通路和非經典的Wnt信號通路，Wnt/β-catenin為經典的Wnt信號通路。當Wnt信號受到刺激時，其配體和受體結合，胞質內β-catenin蛋白積累，進入細胞核，并結合細胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)激活cyclinD1、c-myc等下游靶基因，進而影響腫瘤生物學特性〔10,11〕。有研究顯示，抑制Wnt/β-catenin信號通路可降低包括結腸癌在內的多種腫瘤發生發展〔12〕。XAV-939為Wnt/β-catenin信號通路抑制劑，可抑制多種腫瘤生長〔13,14〕。cyclinD1為調控細胞周期的因子，可對細胞增殖及周期完成起促進作用，在結腸癌中表達升高，其表達升高與結腸癌預后、臨床分期等密切相關〔15〕。Survivin也是Wnt信號通路的下游靶基因，為凋亡抑制基因，結腸癌中表達升高，抑制其表達可誘導結腸癌細胞凋亡〔16〕。有研究發現，XAV-939可通過調控cyclinD1和survivin表達抑制結腸癌發展〔17,18〕。綜上，ACPS可能通過下調Wnt信號抑制結腸癌增殖和誘導凋亡。