miR-132在動脈粥樣硬化中的表達及對缺氧誘導的血管內皮細胞增殖凋亡的影響

梁慧敏 李玉珠 鄭永麗 孫嬌 高洋

(河南大學淮河醫院神經內科，河南 開封 475000)

研究表明，小分子RNA(miRNA)在動脈粥樣硬化斑塊形成及發展過程中起重要的基因調控作用〔3〕，其參與血管平滑肌細胞的增殖和遷移、巨噬細胞功能形成及內皮細胞功能變化〔4，5〕。miR-132是內皮細胞特異性miRNA之一，在心血管疾病調節方面發揮重要作用〔7〕。在內皮細胞中，miR-132可通過調節鳥苷三磷酸(GTP)酶活性蛋白P120RasGAP，參與靜態內皮細胞的增殖、活性、遷移及毛細血管生成〔8〕。對患有視網膜疾病及癌癥的小鼠眼球miR-132的拮抗劑可抑制小鼠病變部位血管生成，阻止病情發展〔9〕。在動脈硬化發生及發展中miR-132的作用研究的尚未清楚。本研究探討miR-132在動脈粥樣硬化中的表達及對缺氧誘導的血管內皮細胞增殖凋亡的影響。

1 材料方法

1.1研究對象 收集河南大學淮河醫院2014年2月至2016年6月動脈粥樣硬化患者50例為動脈硬化組，患者均符合動脈粥樣硬化入選標準，其中男23例，女27例，年齡51～80歲，平均年齡為(68.8±10.5)歲?；颊呔丛眠^心血管藥物或自行停服1 w以上，患者均無吸煙史、慢性心力衰竭、血液循環疾病、急性心腦血管病、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能異常等。另選擇50例性別、年齡等相匹配的體檢正常者作為對照組，其中男25例，女25例，年齡48～79歲，平均年齡(66.2±9.7)歲。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、ECM培養基、LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自美國Gibco公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、CCK8試劑盒、膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自大連TaKaRa；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體均購自美國abcam公司；酶標儀、流式細胞儀均購自美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司。

1.3miR-132基因mRNA表達水平測定 RNA提取試劑盒提取對照組及動脈硬化患者全血中的總RNA，反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，以U6作為內參，以cDNA為模板按照試劑盒的操作說明擴增miR-132基因。所有引物通過Oligo7.0軟件設計，由上海生工合成。實驗數據(Ct值)采用2-△△Ct法進行統計。

1.4細胞培養 人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)從臍帶靜脈提取，用ECM完全培養液置于37℃，5% CO2培養箱中培養，24 h后更換培養液去除未貼壁的細胞，之后每2 d換液1次直至細胞生長融合。實驗為對數生長期的細胞。

1.5細胞轉染及轉染效果檢測 細胞轉染按照LipofectamineTM2000轉染說明進行操作。轉染前將人臍靜脈血管內皮(HUVECs)細胞接種至6孔細胞培養板中，細胞生長達到80%融合時可進行轉染。轉染分為3組，即空轉染組(細胞加入脂質體)、陰性對照組(細胞加入脂質體及陰性對照組試劑)和轉染組(細胞加入脂質體及miR-132抑制劑)。轉染48 h后，按照1.3方法檢測各組細胞中miR-132 mRNA表達量。

1.6細胞增殖檢測 HUVECs細胞分為3組：正常培養組、缺氧組、缺氧+miR-132抑制劑組。利用AnaeroPack-Anaero厭氧培養產氣袋建立內皮細胞缺氧培養模型。缺氧培養HUVECs細胞48 h，收集細胞。每孔細胞中加入10 μl的CCK8溶液，37℃孵育4 h。利用空白對照孔調零，酶標儀490 nm波長下測定各孔吸光值(A)，實驗重復3次。

1.7細胞凋亡檢測 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。取按照1.6分組培養48 h的細胞，加入預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml。按照細胞凋亡試劑盒的操作說明檢測各組細胞的凋亡情況。

1.8Western印跡法 取上述分組培養48 h的細胞，加入適量的RIPA裂解液提取細胞中的蛋白，應用BCA試劑盒將各樣本蛋白定量，每泳道30 μg蛋白樣品經10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉法將凝膠上蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉封閉，4℃孵育Cleaved Caspase3、PI3K、p-AKT(1∶1 000稀釋)、GAPDH(1∶5 000稀釋)一抗過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，再次洗膜后置于暗室中顯影、定影。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1動脈硬化中miR-132的表達 對照組及動脈硬化組中miR-132 mRNA表達分別為(0.904±0.173)、(6.265±0.827)，miR-132在動脈硬化組中的表達顯著高于對照組(t=10.990，P=0.000)。

2.2各組細胞中miR-132 mRNA的表達 空轉染組、陰性對照組及轉染組miR-132 mRNA表達分別為(1.000±0.110)、(1.005±0.112)、(0.218±0.051)，陰性對照組miR-132 mRNA表達與空轉染組差異無統計學意義(t=0.055，P=0.959)，而轉染組miR-132 mRNA表達顯著低于空轉染組(t=11.171，P=0.000)。

2.3抑制miR-132表達可促進缺氧誘導的HUVECs細胞增殖 缺氧組及缺氧+miR-132抑制劑組細胞的增殖均顯著低于正常培養組(均P<0.05)，而缺氧+miR-132抑制劑組細胞的增殖顯著高于缺氧組(P<0.05)。見表1。

2.4抑制miR-132表達可降低缺氧誘導的HUVECs細胞凋亡 缺氧組及缺氧+miR-132抑制劑組的細胞凋亡率顯著高于正常培養組(P<0.05)，而缺氧+miR-132抑制劑組的細胞凋亡率顯著低于缺氧組(P<0.05)。見表1。

2.5抑制miR-132表達對缺氧誘導的HUVECs細胞Cleaved Caspase3、PI3K、p-AKT蛋白表達的影響 見表1、圖1。

表1 各組細胞增殖、凋亡率及Cleaved Caspase3、PI3K、p-AKT的蛋白表達比較

與正常培養組比較：1)P<0.05；與缺氧組比較：2)P<0.05

1：正常培養組；2：缺氧組；3：缺氧+miR-132抑制劑組圖1 Western印跡檢測Cleaved Caspase3、PI3K、p-AKT的蛋白表達

缺氧組及缺氧+miR-132抑制劑組Cleaved Caspase3的蛋白表達顯著高于正常培養組(P<0.05)，PI3K、p-AKT蛋白表達顯著低于正常培養組(P<0.05)；缺氧+miR-132抑制劑組Cleaved Caspase3蛋白表達顯著低于缺氧組(P<0.05)，PI3K、p-AKT蛋白表達顯著高于缺氧組(均P<0.05)。

3 討 論

動脈粥樣硬化是心血管疾病的一個主要危險因素，內皮細胞功能異常是其一系列改變的始動者。研究發現，miRNA可能在動脈粥樣硬化的進程中發揮重要作用〔10〕。miRNA是一種內源性表達的非編碼小分子RNA，在轉錄后水平調節基因的表達，其表達模式的改變可影響血管內皮細胞的功能〔11〕。在動脈粥樣硬化形成過程中，血管內皮細胞的變化發揮重要作用〔12〕。血管內皮細胞的增殖及遷移促進了粥樣斑塊的形成，加速了冠狀動脈粥樣硬化的進程〔13〕。而內皮細胞的增殖、遷移受到miRNA的調控。如miR-221可通過靶向p27促進血管內皮細胞增殖〔14〕；miR-143的缺失或減少可促進血管內皮細胞的增殖、遷移和分化，從而促進冠狀動脈粥樣硬化的發生〔15〕。miR-132在動脈粥樣硬化中的研究較少。有研究顯示，在正常血管內皮細胞形成及再生中，血管壁內皮細胞miR-132表達升高，在人臍靜脈內皮細胞中，miR-132可通過抑制信息調節因子2相關酶(SIRT)1表達，控制膽固醇及脂肪生成〔16，17〕。這提示miR-132在動脈粥樣硬化中有重要作用。

本研究中檢測到miR-132在動脈粥樣硬化中高表達，通過建立內皮細胞缺氧培養模型，并經脂質體將miR-132的抑制物轉染至細胞，檢測細胞的增殖及凋亡情況。結果顯示，缺氧可顯著降低細胞的增殖，誘導細胞的凋亡，上調Cleaved Caspase3蛋白表達，而miR-132的抑制物可減弱這種效應。細胞凋亡受到多種途徑的調控，其中Caspase家族在細胞凋亡過程中發揮重要作用。Caspase3是Caspase家族的關鍵酶，在正常組織中主要以無活性的形式存在，多種凋亡途徑最終都會引起Caspase3的活化，其活化是凋亡進入不可逆階段的標志〔18，19〕。有研究顯示，在動脈粥樣硬化中Caspase3的表達上調〔20〕。這說明miR-132可通過調節Caspase3表達降低血管內皮細胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路在炎癥反應、多種腫瘤細胞中均發揮重要作用，該通路中相關的分子、基因的表達異?？梢鸺毎脑鲋场⑶忠u、凋亡的異?！?1〕。研究顯示，PI3K/AKT信號通路參與動脈粥樣硬化的形成，包括平滑肌細胞功能異常、內皮細胞凋亡、血管收縮、炎癥細胞聚集等〔22〕。在動脈粥樣硬化發展過程中，缺氧、炎癥因子、氧化應激等可導致PI3K及磷酸化的AKT迅速失活，使凋亡基因表達上調，從而誘導內皮細胞的凋亡〔23〕。本研究為了進一步研究引起血管內皮細胞增殖凋亡的機制，通過Western印跡檢測PI3K/AKT信號通路PI3K、p-AKT的表達，結果顯示，抑制miR-132表達可上調PI3K、p-AKT的表達。這說明抑制miR-132表達可通過激活PI3K/AKT信號通路影響細胞的增殖凋亡。

綜上所述，miR-132在動脈粥樣硬化中高表達，抑制其表達可減弱由缺氧誘導的血管內皮細胞的增殖降低及凋亡增加，其機制與激活PI3K/AKT信號通路有關。