PBX3基因調(diào)控p38MAPK信號(hào)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及5-氟尿嘧啶化療敏感性的影響

徐卓 張萌 張志磊 賈聿明 王超 彭利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011)

全球范圍內(nèi)的肝癌發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)〔1〕。肝癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因、抑癌基因等的異常表達(dá)密切相關(guān)。前B細(xì)胞白血病同源盒基因(PBX)3與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PBX3表達(dá)量與前列腺癌惡性程度呈正相關(guān)〔2〕；PBX3可逆轉(zhuǎn)Let-7c對(duì)結(jié)腸癌生長(zhǎng)抑制作用〔3〕；結(jié)直腸癌中PBX3高表達(dá)，可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲及遷移〔4〕。miR-33a-3p可通過(guò)靶向抑制PBX3降低肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力〔5〕。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種常用的廣譜抗腫瘤藥物，通過(guò)影響DNA復(fù)制，參與細(xì)胞周期調(diào)控，目前已發(fā)現(xiàn)5-FU可協(xié)同藥物、分子靶向等用于肝癌的治療〔6〕。本研究通過(guò)干擾PBX3表達(dá)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖活力、凋亡和對(duì)5-FU化療敏感性的影響，并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。

1 材料方法

1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 人正常肝細(xì)胞HL-7702及肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC。RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗、FBS、胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)Gibco；Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京天根生化；噻唑藍(lán)(MTT)溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒購(gòu)自上海博古生物；PBX3、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38MAPK、磷酸化(p)-p3 8MAPK及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD；酶標(biāo)儀購(gòu)自上海賽默生物。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS及雙抗的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HL-7702、Huh7、MHCC-97H、HepG2和SMMC7721細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱條件設(shè)定為CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度分?jǐn)?shù)95%和溫度37℃。2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)80%后，以胰酶消化傳代。選取生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。人正常肝細(xì)胞HL-7702為對(duì)照細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721細(xì)胞中PBX3的蛋白表達(dá)。

1.3siRNA轉(zhuǎn)染 依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)針對(duì)PBX3的特異性siRNA(si-PBX3組)，同時(shí)設(shè)計(jì)不具有干擾作用的siRNA(NC組)，均由上海吉瑪合成。以2.5×104/ml細(xì)胞密度接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的SMMC7721細(xì)胞于6孔板，每孔2 ml細(xì)胞懸液，觀察到細(xì)胞達(dá)90%以上生長(zhǎng)融合時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000的說(shuō)明書步驟，將制備的Lip2000與siRNA混合物加入6孔板，僅加入脂質(zhì)體的為空白對(duì)照組，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞活力檢測(cè) SMMC7721細(xì)胞分為4組處理：NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組。NC組和si-PBX3組分別轉(zhuǎn)染不具有干擾作用的siRNA及靶向抑制PBX3的siRNA，5-FU組用不具有干擾作用的siRNA及10 μmol/L的5-FU處理細(xì)胞，si-PBX3+5-FU組用靶向抑制PBX3的siRNA及10 μmol/L的5-FU處理細(xì)胞。將SMMC7721細(xì)胞按照每孔3×103個(gè)密度接種于96孔板，孵育24 h后，根據(jù)上述分組處理細(xì)胞。處理48 h后，收集NC組、si-PBX3組、5-FU和si-PBX3+5-FU細(xì)胞，加入MTT溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，常規(guī)孵育4 h，加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液在每孔細(xì)胞中，緩慢震蕩混勻10 min，490 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定各組吸光度值(A值)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 處理48 h后，收集NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌后，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，以500 μl的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，加入5 μl的AnnexinV-FITC染色液在細(xì)胞懸浮液中，避光室溫孵育15 min，再加10 μl的PI染色液，避光室溫孵育5 min，加300 μl的1×結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡法 處理48 h后，收集NC組、si-PBX3組、5-FU組和si-PBX3+5-FU組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取各組SMMC7721細(xì)胞的總蛋白，并采用Bradford法對(duì)總蛋白定量。按照每孔道40 μg上樣量將蛋白樣品上樣中十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中，電泳分離結(jié)束后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，浸入5%的脫脂奶粉中封閉1 h后，加1∶1 000稀釋的PCNA、Bax、PBX3、p38MAPK和p-p38MAPK抗體，4℃孵育過(guò)夜。再加入1∶2 000稀釋的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。凝膠系統(tǒng)掃描分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PBX3基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) HL-7702、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMMC7721細(xì)胞中PBX3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為：(0.053±0.008)、(0.226±0.020)、(0.287±0.027)、0.509±0.048)、(0.674±0.056)。肝癌細(xì)胞中PBX3蛋白表達(dá)均顯著高于HL-7702細(xì)胞(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2各組PBX3蛋白表達(dá)結(jié)果 PBX3在si-PBX3組中的表達(dá)(0.071±0.010)顯著低于空白對(duì)照組(0.292±0.030，P<0.05)，而在NC組的表達(dá)(0.320±0.032)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)PBX3蛋白表達(dá)

圖2 各組PBX3蛋白表達(dá)

2.3各組細(xì)胞活力比較 si-PBX3組和5-FU組細(xì)胞活力均顯著低于NC組(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU組細(xì)胞活力顯著低于si-PBX3組和5-FU組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組細(xì)胞凋亡率比較 si-PBX3組和5-FU組細(xì)胞凋亡率均顯著高于NC組(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU組細(xì)胞凋亡率顯著高于si-PBX3組和5-FU組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

2.5各組p38MAPK、p-p38MAPK、PCNA、Bax蛋白表達(dá)比較 si-PBX3組和5-FU組細(xì)胞PCNA及p-p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著低于NC組，Bax蛋白表達(dá)顯著高于NC組(P<0.05)，而si-PBX3+5-FU組PCNA及p-p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著低于si-PBX3組和5-FU組，Bax蛋白表達(dá)顯著高于si-PBX3組和5-FU組(P<0.05)。4組p38MAPK蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

表1 各組細(xì)胞活力、凋亡率及PCNA、Bax、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

與NC組比較；1)P<0.05；與si-PBX3+5-FU組比較：2)P<0.05

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

圖4 PBX3 siRNA或5-FU對(duì)SMMC7721細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的影響

3 討 論

如何有效增強(qiáng)化療效果、提高化療藥物敏感性及減輕化療引起的不良反應(yīng)成為腫瘤治療研究一個(gè)熱點(diǎn)。PBX3屬于含有三氨基酸突出環(huán)(TALE)的PBX家庭成員的同源基因，可與Hox蛋白互作，增強(qiáng)Hox蛋白結(jié)合DNA的親和力，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。作為原癌基因PBX1的同源基因， PBX3與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在潛在關(guān)系。研究表明，PBX3過(guò)表達(dá)可增加胃癌細(xì)胞增殖能力，上調(diào)公認(rèn)的細(xì)胞增殖標(biāo)記PCNA表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力〔7〕。PBX3與同源盒基因(HOX)A9可協(xié)同促進(jìn)白血病的生成，沉默PBX3的表達(dá)可抑制正常急性髓系白血病細(xì)胞生長(zhǎng)及增加化療敏感性〔8〕；以上研究結(jié)果表明，在人類腫瘤中PBX3作為癌基因起作用。葛根素聯(lián)合5-FU治療SMMC7721肝癌細(xì)胞有協(xié)同作用，并可增強(qiáng)5-FU對(duì)肝癌細(xì)胞作用的敏感性〔9〕；RNA干擾沉默增強(qiáng)子同源物(EZH)2基因可以增強(qiáng)Bel/FU細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性〔10〕。PBX3對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及是否增強(qiáng)肝癌5-FU的敏感性還未明確。

RNA干擾(RNAi)是一種新的在轉(zhuǎn)錄后阻斷基因表達(dá)的技術(shù)，由雙鏈RNA介導(dǎo)，具有高效性、特異性，與其他基因腫瘤治療方法比較，RNAi技術(shù)呈現(xiàn)出更高的特異性及更強(qiáng)的抑制目的基因表達(dá)特性，因此，RNAi技術(shù)已用于基因功能研究、基因治療等方面〔11,12〕。本研究結(jié)果顯示，PBX3 siRNA及5-FU均可抑制SMMC7721細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合對(duì)細(xì)胞活力抑制及凋亡促進(jìn)作用更明顯。這提示PBX3 siRNA可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增加5-FU肝癌化療敏感性。

MAPK信號(hào)是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)存在，參與細(xì)胞增殖、凋亡、周期及分化等的調(diào)控，在真核細(xì)胞中，已確定有ERK、JNK、p38MAPK和ERK5 4條MAPK信號(hào)通路，與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在乳腺癌、食管癌、肺癌等腫瘤中呈現(xiàn)持續(xù)激活表達(dá)〔13～15〕。抑制p38MAPK信號(hào)可降低肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔16〕。PCNA是常用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物〔17〕，Bax是Bcl-2家族促凋亡蛋白，在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)降低〔18,19〕。本研究結(jié)果顯示，PBX3 siRNA及5-FU均可下調(diào)p-p38MAPK及PCNA表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)。這提示PBX3 siRNA抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及5-FU化療增敏可能與下調(diào)p38MAPK信號(hào)有關(guān)。

綜上，PBX3基因表達(dá)的抑制可降低肝癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌5-FU化療敏感性，機(jī)制可能與下調(diào)p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。本研究可能為肝癌分子靶向治療及5-FU肝癌化療增敏提供了一定的理論基礎(chǔ)。