小RAN干擾Trx1促進大鼠缺血再灌注損傷的星形膠質細胞凋亡、抑制其增殖及作用機制

歐陽波 陳勇軍 唐小容 張衡生 紀雄英

(南華大學附屬南華醫院 1中醫康復科，湖南 衡陽 421002；2腔鏡室；3神經內科)

缺血再灌注損傷發生時，腦組織內氧化反應異常，機體內自由基得到積累，引起細胞內能量代謝障礙、DNA斷裂等，最終促進神經細胞凋亡〔1～4〕。神經細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷機制的研究中發揮重要作用。探究中斷腦缺血誘導神經細胞的凋亡這一級聯反應的潛在靶點是目前研究的熱點和重點。硫氧還蛋白(Trx)1，具有強大的抗氧化和抗凋亡作用〔5〕，但目前關于Trx1調控神經細胞凋亡的具體作用機制仍不清楚。本實驗探討Trx1對氧糖剝奪的星形膠質細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠(出生48 h內)購自北京維通利華實驗動物有限公司，雌雄不限，體重10～13 g。

1.2主要試劑和儀器 DMEM培養基、胰酶、胎牛血清購自美國Gibco公司，反轉錄試劑盒、細胞裂解液購自北京康為試劑生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉染試劑盒、Trizol、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Invitrogen公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，Trx1抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體、活化的(Cleaved)Caspase-3抗體、B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司。

1.3細胞的培養 根據參考文獻〔6〕，收集并鑒定大鼠原代星形膠質細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，放入37℃、5%CO2的細胞培養箱中，每隔2 d更換一次培養基，其細胞濃度達到70%～80%，加入胰酶消化，以1∶2或1∶3的比例進行傳代。

1.4缺血再灌注損傷模型的構建 選取生長狀態良好的星形膠質細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，置于培養箱中培養24 h，更換為不含血清的培養基，5%CO2、95%N2環境中培養6 h，棄去培養基，加入含10%胎牛血清的新鮮培養基，5%CO2的培養箱中復氧24 h，以正常培養的細胞作為對照，進行后續實驗。

1.5細胞的轉染 將星形膠質細胞分為4組，對照組、氧糖剝奪(OGD)模型組、小干擾(si)RNA-NC組、siRNA-Trx1組。轉染前24 h，選取生長狀態良好的星形膠質細胞，調整為5×105個，待細胞濃度達到80%～90%開始轉染。將培養基更換為Opti-MEM，稀釋A液：將siRNA和Lipofectamine 2000分別與Opti-MEM培養基混合均勻，室溫孵育10 min；然后將兩稀釋液充分混合，室溫靜置5 min，每孔細胞中加入上述復合物，37℃培養4～6 h，更換為完全培養基。

1.6實時熒光定量PCR(qPCR) 收集5×105個細胞，加入1 ml Trizol提取細胞中總RNA，反轉錄為cDNA。以GAPDH為內參，cDNA為模板，進行擴增。引物由上海生工生物有限公司合成，Trx1引物上游序列為5′-CCTTCTTTCATTCCCTCTGTGA-3′，下游序列為5′-CCCAACCTTTTGACCCTT TTTA-3′。反應條件為95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40個循環。實驗重復3次，結果采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.7MTT檢測細胞的增殖 將各組星形膠質細胞密度調整5×103個，接種與96孔板上，培養48 h，每孔加入50 μl MTT，37℃孵育4 h后，每孔加入150 μl DMSO，搖床中振蕩10 min，酶標儀檢測細胞490 nm波長的吸光值。

1.8流式細胞術檢測細胞的凋亡 根據凋亡試劑盒說明書所示，收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，加入100 μl細胞緩沖液，加入Annexin V-FITC和PI，避光，4℃染色15 min，然后加入400 μl細胞緩沖液，流式細胞儀分析各組細胞的凋亡率。

1.9免疫印跡實驗 棄去培養液，預冷的PBS清洗3次，加入適量細胞蛋白裂解液，冰浴15 min，收集上清即為細胞總蛋白。BCA試劑盒法測定蛋白質濃度。取200 μl蛋白樣品，沸水加熱5 min，使蛋白充分變性；加入電泳液，吸取40 μg總蛋白加入上樣孔，上層膠電壓為80 V，電泳30 min，下層膠電壓為100 V，電泳100 min。根據目的蛋白分子量大小，切凝膠帶，依次放入濾紙、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、凝膠、濾紙，恒定電壓105 V轉膜105 min；將PVDF膜置于封閉液中，輕輕搖動1 h；加入一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次×10 min，加入二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗3次×10 min，避光，加入電化學發光(ECL)液，凝膠成像儀中拍照，Quantity One軟件分析蛋白質灰度值。

1.10統計學分析 SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞中Trx1基因的表達量比較 OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組Trx1 mRNA表達量較對照組顯著增加(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組Trx1的表達量差異無統計學意義(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質細胞中Trx1 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2下調Trx1基因的表達量對星形膠質細胞增殖的影響 與對照組相比，OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組星形膠質細胞增殖顯著下降(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組星形膠質細胞增殖差異無統計學意義(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質細胞增殖顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3下調Trx1基因的表達量對細胞凋亡的影響 與對照組相比，OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組星形膠質細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質細胞凋亡顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組Trx1基因表達、細胞增殖、細胞凋亡及凋亡相關蛋白水平比較

與對照組相比：1)P<0.05；與OGD模型組相比：2)P<0.05

2.4下調Trx1基因的表達量對星形膠質凋亡相關蛋白水平的影響 各組Caspase-3蛋白的表達量差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組相比，OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組細胞中Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達量均顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達量顯著降低(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組星形膠質細胞中凋亡相關蛋白無顯著變化(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質細胞中Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達量顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達量顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

1～4：對照組、OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組圖1 Western印跡檢測各組Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白表達

3 討 論

星形膠質細胞是神經細胞的重要成員之一，有助于維持中樞神經系統結構和功能的完整性。研究表明，星形膠質細胞具有多種生理功能，比如調節神經系統的新陳代謝、處理細胞外的有毒物質、對血管結構完整性的維持、調控神經突觸的生成和遞質的釋放〔7～10〕。腦缺血再灌注損傷過程中，星形膠質細胞功能紊亂進一步促進神經元的損傷，因此，探究腦缺血再灌注損傷過程中減少星形膠質細胞的凋亡具有重要的作用。研究表明，氧糖剝奪損傷促進星形膠質細胞的凋亡〔11〕。研究表明，Trx1具有抗凋亡和氧化、降低炎癥反應、保護腦缺血再灌注損傷和調節蛋白質結構等作用。在Trx1表達量上調的轉基因小鼠中，通過構建大腦中動脈缺血模型發現，模型小鼠的受損區顯著小于對照組，神經細胞的凋亡率明顯降低〔12〕。在腦缺血過程中，星形膠質細胞發生氧化應激損傷的程度顯著小于神經元，其中Trx1的基礎活性及誘導水平均顯著增加〔13〕。本實驗結果表明，Trx1可抑制氧糖剝奪損傷的星形膠質細胞凋亡、促進其增殖，從而對腦缺血損傷發揮保護作用。

在細胞的凋亡過程中，Bcl-2、Bax與凋亡發生、發展密切相關。Bcl-2、Bax表達量的變化決定細胞凋亡程序是否啟動，其中Bcl-2在細胞凋亡過程中發揮抗凋亡的作用，其表達量的增加會抑制細胞的凋亡率；Bax在細胞凋亡過程中發揮促凋亡作用，其表達量的增加會促進細胞凋亡〔14～16〕。研究表明Bcl-2、Bax參與過氧化氫誘導的星形膠質細胞凋亡調控過程〔17〕。體外共培養間充質干細胞和星形膠質細胞，其中間充質干細胞分泌的白細胞介素6阻礙氧糖剝奪的星形膠質細胞的凋亡，其作用機制與促進星形膠質細胞中Bcl-2的表達量和降低Bax的表達量密切相關〔18〕。Caspase-3是細胞凋亡過程中重要的蛋白酶之一，是多種細胞介導的凋亡信號通路的共同下游靶蛋白，使細胞凋亡過程中蛋白級聯反應的樞紐〔19，20〕。本研究經過構建氧糖剝奪損傷的星形膠質細胞，發現Bcl-2蛋白水平明顯降低，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平顯著增加，而抑制Trx1表達量后，星形膠質細胞中Bcl-2蛋白水平進一步降低，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平進一步增加，表明氧糖剝奪損傷后抑制Trx1表達，可通過調節Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信號通路蛋白的表達量促進細胞的凋亡、抑制細胞增殖。

綜上，抑制氧糖剝奪損傷后的星形膠質細胞中Trx1表達量，顯著促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，其作用機制可能是通過調控Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信號通路蛋白表達量發揮作用。