茯苓酸通過Wnt信號通路對腎癌細胞生物學特性的影響

董建設 趙俊峰 張林超 陳瑞廷 賈占奎 楊錦建

(1河南省中醫院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科)

茯苓酸(PA)是中藥茯苓的有效活性物質，屬于三萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、止吐、抗癌等生物學作用〔1〕。研究發現，PA在乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤中起到抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移的作用，PA抗腫瘤新藥研發領域在國內外備受關注〔2～5〕。PA在抗腫瘤過程中具有多種途徑，可通過抑制磷脂酰肌醇轉移蛋白(PITPNM)3的磷酸化抑制乳腺癌細胞發生轉移〔6〕；通過下調蛋白激酶B(Akt)和細胞外信號調節激酶(ERK)1/2的磷酸化抑制Akt和ERK1/2信號通路的激活抑制膽囊癌細胞生長、侵襲和遷移，使膽囊癌細胞停滯在G1期〔7〕；在膀胱癌BIU87細胞中可通過誘導含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3活性，上調Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達，啟動內源性細胞凋亡途徑誘發細胞凋亡〔8〕。Wnt信號通路參與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡等生物學行為的過程〔9,10〕。目前關于PA對腎癌抑制作用的研究鮮有報道。本研究以人腎癌786-0細胞為研究對象，觀察PA對腎癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，并對其作用的分子機制進行探討。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌786-0細胞株購于中國科學院上海生命科學院細胞庫；PA購于上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI1640培養基購于美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購于上海古朵生物科技有限公司；Transwell小室購于北京萌壯科技有限公司；Wnt抗體、β-catenin抗體、Cyclin D1抗體、辣根過氧化物標記的抗體均購于美國Abcam公司。

1.2腎癌786-0細胞培養和分組 人腎癌786-0細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，細胞置于37℃、含5%體積分數CO2飽和濕度的培養箱中培養，隔日以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取處于對數生長期生長良好的腎癌細胞接種于96孔板，每孔104個細胞，過夜培養待細胞貼壁后，去除上清，加入含PA的RPMI1640培養液，調整PA終濃度分別為10、20、40、80 μg/ml，以不加PA正常培養的腎癌細胞為對照組，每組設置6個平行孔，置于細胞培養箱中繼續培養。

1.3MTT法檢測腎癌細胞增殖抑制情況 各組細胞于37℃、100%濕度培養箱分別培養0、24、48、72 h，每孔細胞中加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，放置于37℃條件下反應4 h，去掉上清液，再在每孔中加入20 μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕混勻后，置于搖床上低速振蕩10 min，待結晶物充分溶解，在酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度值(A值)。實驗重復3次取平均值。以對照組測得的A值為對照，計算各組細胞增殖抑制率百分比，細胞增殖抑制率=1-(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4流式細胞術檢測腎癌細胞凋亡情況 培養24 h的各組腎癌細胞，用胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組細胞2次，4℃條件下2 000 r/min離心5 min，加入200 μl的結合緩沖液混勻重懸細胞，用移液槍吹打成單細胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl PI混勻，置室溫下避光孵育15 min，待腎癌細胞結合Annexin V-FITC和PI后，在每個流式上樣管中加入不少于104個細胞，于流式細胞儀檢測各組腎癌細胞凋亡情況。

1.5Transwell實驗檢測腎癌細胞侵襲能力 取處于對數生長期的腎癌細胞，饑餓處理24 h后，用PBS洗滌細胞3次，胰蛋白酶消化后，用無血清培養基重懸細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為2×105/ml，取200 μl細胞懸液接種到Transwell上室，取800 μl含20%胎牛血清的培養基加入到下室，置于37℃培養箱繼續培養24 h。取出Transwell小室，用PBS洗滌3次，用4%的多聚甲醛固定20 min，用0.1%結晶紫染色15 min，再用PBS洗滌3次，在倒置顯微鏡下觀察計數穿膜細胞個數，平均每個視野的細胞數表示腎癌細胞的轉移能力。

1.6劃痕實驗檢測腎癌細胞遷移能力 先用標記筆在6孔板背面均勻得劃橫線，橫線之間的距離約為1 cm，橫線需穿過孔。在每孔中加入約5×105/孔數量處理的腎癌細胞，培養過夜使之鋪滿培養皿底部，第2天用200 μl槍頭垂直于底部橫線做約為0.8 mm的劃痕，保證槍頭垂直，用PBS洗滌細胞3次，除去用槍頭劃下的細胞，加入無血清培養基。置于37℃含5%CO2的細胞培養箱進行培養。于 0、12、24 h取樣拍照，測量各組腎癌細胞在各個時間點遷移的距離。

1.7Western印跡檢測腎癌細胞中Wnt、β-catenin、Cyclin D1表達水平 各組腎癌細胞分別培養24 h，消化后收集各組細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法對提取的蛋白濃度進行定量檢測。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%牛血清蛋白室溫封閉60 min，分別加入相應的一抗Wnt(1∶800稀釋)、β-catenin(1∶800稀釋)、Cyclin D1(1∶1 000稀釋)4℃過夜孵育，再加入1∶2 000稀釋的二抗在室溫下孵育2 h。采用電化學發光(ECL)試劑盒進行顯色，成像系統掃描，用軟件分析各組腎癌細胞中Wnt、β-catenin、Cyclin D1蛋白水平。

1.8Wnt信號通路激活劑對腎癌細胞凋亡的影響 用Wnt信號通路激活劑20 mmol/L的氯化鋰(LiCl)處理40 μg/ml PA誘導的腎癌細胞，記為PA+LiCl組，40 μg/ml PA誘導的腎癌細胞作為對照，記為PA組，采用流式細胞術檢測處理后24 h腎癌細胞凋亡率，步驟同1.4。

1.9統計學分析 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1PA對腎癌細胞增殖的影響 與0 μg/ml PA組相比，10、20、40、80 μg/ml組24、48、72 h腎癌細胞增殖抑制率均顯著升高(均P<0.05)。10、20、40 μg/ml組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，40、80 μg/ml組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。10、20、40、80 μg/ml組與前1時間點比較細胞增殖抑制率均顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度PA對腎癌細胞增殖抑制率比較

與0 μg/ml組比：1)P<0.05；與10 μg/ml組比：2)P<0.05；與20 μg/ml組比：3)P<0.05；與同濃度下24 h比較：4)P<0.05；與同濃度下48 h比較：5)P<0.05

2.2PA對腎癌細胞凋亡的影響 與0 μg/ml組相比，10、20、40、80 μg/ml腎癌細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；20、40、80 μg/ml組與10 μg/ml組比較、40、80 μg/ml組與20 μg/ml組比較差異均具有統計學意義(均P<0.05)，80 μg/ml組與40 μg/ml組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3PA對腎癌細胞侵襲和遷移能力的影響 10、20、40、80 μg/ml組腎癌細胞遷移距離及穿膜細胞數與對照組相比明顯減少(均P<0.05)，且呈濃度依賴性，隨PA濃度增加遷移距離及穿膜細胞數均顯著減小(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度PA對腎癌細胞凋亡率及侵襲、遷移的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05；與10 μg/ml組比較：2)P<0.05;與20 μg/ml組比較：3)P<0.05；與40 μg/ml組比較，4)P<0.05；下表同

2.4PA對Wnt信號通路相關蛋白Wnt、β-catenin、Cyclin D1的影響 0、10、20、40、80 μg/ml濃度組腎癌細胞Wnt、β-catenin、Cyclin D1水平組間兩兩比較差異均具有統計學意義(均P<0.05)。見圖1、表3。

2.5Wnt信號通路激活劑對腎癌細胞凋亡的影響 與PA組〔(43.35±4.11)%〕相比，PA+LiCl組腎癌細胞凋亡率明顯降低〔(25.18±2.14)%，P<0.05〕。

圖1 Western印跡檢測PA不同濃度組腎癌細胞中Wnt、β-catenin和Cyclin D1的表達水平

PA濃度(μg/ml)Wntβ-cateninCyclin D101.25±0.201.13±0.120.97±0.10100.94±0.101)0.89 ±0.101)0.77 ±0.071)200.68±0.071)2)0.60±0.071)2)0.55±0.041)2)400.41±0.041)2)3)0.38±0.041)2)3)0.30±0.031)2)3)800.27±0.021)2)3)4)0.24±0.021)2)3)4)0.18±0.021)2)3)4)

3 討 論

PA能夠顯著抑制前列腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌等多種腫瘤的發展，近年來成為國內外研究抗腫瘤藥物的熱點〔11～13〕。抗腫瘤活性與藥物能夠抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤的轉移，誘導腫瘤細胞凋亡密切相關〔14,15〕。PA可呈濃度依賴性的抑制人前列腺癌LNCaP和DU145細胞增殖，這種對細胞的抑制效應是通過誘導前列腺癌細胞凋亡實現的〔16〕。研究發現，以不同濃度的PA處理非小細胞肺癌A549細胞后，低濃度的PA可抑制細胞侵襲能力，當PA濃度到達30 mmol/L時可抑制細胞增殖，且以濃度依賴性的抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖，后續研究發現，PA可干擾線粒體膜電位促進非小細胞肺癌A549細胞凋亡〔12〕。PA對4種人胰腺癌AsPc-1、BxPc-3、MiaPaca-2和Panc-1細胞系有不同程度的抑制作用，誘導多數胰腺癌細胞停滯于G0/G1期，此外，PA還可通過下調基質金屬蛋白酶(MMP)-7抑制胰腺癌細胞的侵襲能力〔17,18〕。本實驗結果表明PA對腎癌細胞有顯著的細胞增殖抑制作用，且呈濃度和時間依賴趨勢，當PA濃度達到40 μg/ml時與80 μg/ml對細胞增殖抑制作用變化不明顯，提示PA濃度為40 μg/ml時可能達到最大的細胞毒性；且PA可抑制腎癌細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡。PA下游調控因子及其作用的分子機制也被廣泛研究〔19〕。由丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)誘導的乳腺癌細胞中核因子(NF)-κB被激活，經PA處理后，可劑量依賴性的抑制NF-κB的激活，促進乳腺癌細胞增殖。PA可通過調控CDKs和Cyclins等調控因子將腫瘤細胞阻滯于某一細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖，起到抗癌作用〔3〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和ERK1/2信號通路參與腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲浸潤等過程，PA可通過調控MAPK和ERK1/2信號通路抑制膽囊癌的發展〔7，20，21〕。PA通過調控Akt信號通路降低鼠病毒性心肌炎中心肌細胞的損傷，減少心肌細胞凋亡〔22〕。研究表明，PA可通過調控多種信號通路起到抗癌作用。本研究發現經PA處理的腎癌細胞中Wnt、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表達量明顯降低，提示PA可抑制Wnt信號通路的激活；在40 μg/ml PA誘導是腎癌細胞中添加Wnt信號激活劑，發現腎癌細胞凋亡減少。PA通過調控Wnt信號通路影響腎癌細胞凋亡。

PA抑制腎癌細胞增殖和侵襲，通過抑制Wnt信號通路的激活促進細胞凋亡，為腎癌的預防和治療提供基礎實驗研究。