AT2R通過NF-κB信號對人膝骨關節炎滑膜組織成纖維樣細胞中IL-6、IL-1β表達的影響

宋鵬 荊凱 魏鵬飛 孫永強 譚斌

(1河南省中醫院燒傷顯微修復科，河南 鄭州 450002；2河南省骨科醫院骨科；3中國人民解放軍第113醫院顯微手足外科)

骨關節炎(OA)是一種關節軟骨慢性退行性病變，以軟骨變性、骨質增生、滑膜炎為主要病理特征〔1〕。關節炎主要由淋巴細胞、巨噬細胞和滑膜襯里成纖維細胞驅動，也被稱為成纖維細胞樣滑膜細胞(FLS)或B型滑膜細胞〔2〕。過度增生的FLS能夠通過局部產生促炎性細胞因子如白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及小分子炎癥介質來促進滑膜炎的初始階段〔2,3〕，因此，控制FLS異常增殖是治療OA的重要途徑〔4〕。血管緊張素Ⅱ具有兩種主要的G蛋白耦聯受體亞型，即血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)和血管緊張素Ⅱ 2型受體(AT2R)〔5〕。AT1R在培養的類風濕關節炎(RA)-FLS和關節炎嚙齒動物模型的增生性滑膜中高度表達，其已經被提出作為可能的治療靶點〔6,7〕，但對于AT2R的功能卻知之甚少。本研究將檢測AT2R在膝OA滑膜組織中表達；原代分離培養正常人FLS(H-FLS)和膝OA患者FLS(OA-FLS)，觀察炎癥因子對細胞中AT2R表達影響；干擾與激活OA-FLS中AT2R表達檢測其對IL-6 和IL-1β表達、核因子(NF)-κB活性及細胞增殖影響，以期闡明AT2R在OA發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床標本收集 收集河南省中醫院2014年2月至2015年12月經手術治療膝關節OA患者54例，男24例，女30例，年齡48～65〔平均(55.4±4.1)〕歲，OA診斷均符合美國風濕病學會制訂的膝關節OA診斷標準〔4〕，且OA患者均沒有接受任何緩解疾病的藥物治療。另取36例為無OA病史的創傷性截肢患者作為對照組，男22例，女14例；年齡45～58〔平均(51.6±5.7)〕歲。受試者均簽署書面知情同意書，研究方案獲得醫院倫理委員會批準同意。

1.2FLS細胞分離培養與鑒定 取健康和膝關節OA滑膜組織，用無菌磷酸鹽生理鹽水磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，眼科剪剪去多余脂肪、軟骨等組織并剪成糊狀，加入10倍體積的Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，于37℃、5%CO2細胞培養箱消化2 h，200目不銹鋼篩網過濾，1 500 r/min離心5 min，將收集到的細胞接種至含有15%胎牛血清(Gibco公司)、2 mmol/L谷氨酰胺(Gibco公司)和1%青霉素-鏈霉素(Gibco公司)的RPMI1640培養基(Gibco公司)中培養，待細胞長至約80%融合度時，進行消化傳代培養，取第3～4代對數生長期細胞用于實驗〔4〕，培養3～4代H-FLS和OA-FLS細胞呈梭形，細胞核呈卵圓形位于細胞中央，為了進一步鑒定分離得到的原代滑膜成纖維細胞，分別用CD14、CD90和Vimentin抗體對培養的細胞進行Western印跡檢測，結果如圖1所示，H-FLS和OA-FLS細胞中CD90、Vimentin蛋白表達陽性，CD14蛋白表達陰性，說明該細胞來源于中胚層，并具有成纖維細胞樣特點。分別記為H-FLS和OA-FLS細胞。

1.3Western印跡法 取適量3～4代H-FLS和OA-FLS細胞，用RIPA裂解液(碧云天生物技術有限公司)裂解30 min，取上清液至新的EP管中于4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度，置于-80℃保存。將H-FLS和OA-FLS細胞分別用20 ng/ml的TNF-α(PeproTech公司)、10 ng/ml的IL-1β(PeproTech公司)及兩者聯合處理細胞24 h〔8〕，提取蛋白進行保存，并將各組依次記為TNF-α組、IL-1β組、TNF-α+IL-1β組，以不做任何處理細胞記為空白組。取20 μg蛋白樣品配置成上樣緩沖液，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進行電泳分離，110 V恒壓轉膜1 h，將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用AT2R(Abcam公司)、GAPDH(碧云天生物技術有限公司)一抗孵育過夜，后用相應二抗室溫孵育2 h，采用電化學發光(ECL)液進行曝光顯影，Image J軟件分析各條帶蛋白相對表達量。

1.4沉默細胞中AT2R表達 取對數生長期OA-FLS細胞接種于6孔板中，待細胞過夜長至60%融合度時，根據Lipofectamine?2000(ThermoFisher scientific)轉染試劑說明書將10 nmol/L的AT2R siRNA(siAT2R，Santa Cruz Biotechnology)或陰性對照(NC，Santa Cruz Biotechnology)轉染至細胞中，轉染48 h后，按照1.3中步驟進行Western印跡檢測AT2R蛋白表達。

1.5qPCR檢測IL-6、IL-1β表達 取1.2中分離得到的OA-FLS細胞，轉染NC、siAT2R或用10 μmol/L的AT2R激動劑CGP42112A(Sigma公司)處理24 h，依次記為NC組、siAT2R組和AT2R激動劑組，以不做任何處理細胞作為空白組，使用TRIzol分離提取各組總RNA，Nanodrop 2000測定各組RNA濃度。采用Script Ⅱ逆轉錄酶試劑盒進行逆轉錄，2×SYBR綠色熒光染料試劑盒上機檢測各組細胞IL-6、IL-1β表達，以18S為內參，按照2-ΔΔCt法計算各組細胞中IL-6、IL-1β mRNA相對表達水平。IL-6引物：正義鏈：5′-AAAGAGGCACTGGCAGAAAA-3′，反義鏈：5′-TTTCACCAGGCAAGTCTCCT-3′；IL-1β引物：正義鏈：5′-TTCTTCGACACATGGGATAACG-3′,反義鏈：5′-TCCCGGAGCGTGCAGTTCA-3；18S引物：正義鏈：5′-CCGCAGCTAGGAATAATGGAATA-3′，反義鏈：5′-TCTAGCGGCGCAATACGAAT-3′。

圖1 Western印跡法檢測H-FLS和OA-FLS細胞中蛋白表達

1.6熒光素酶報告基因實驗 人含有NF-κB 結合位點的IL-6啟動子熒光素酶報告基因載體pIL-6-promoter-luc，利用點突變試劑盒(Takara公司)將IL-6啟動子區NF-κB結合位點突變構建pIL-6-promoter-luc-Mut質粒。取對數生長期OA-FLS細胞、NC細胞、siAT2R細胞接種于12孔板中，待細胞過夜長至60%融合度時，根據Lipofectamine?2000(Thermo Fisher scientific公司)轉染試劑說明書將0.25 μg pIL-6-promoter-luc-WT/Mut和0.125 μg phRL-null(Promega公司)共轉染入細胞中，6 h后更換新鮮培養基，分別記為對照組、NC組、siAT2R組，以AT2R激動劑CGP42112A(Sigma公司)處理24 h作為AT2R agonist組。根據雙重熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司)檢測各組相對熒光素酶活性。

1.7細胞增殖檢測 取2×104個OA-FLS細胞接種至96孔板中培養過夜，后將細胞用無血清培養基洗滌3次，并在含0.2%胎牛血清的RPMI1640中再溫育24 h。將FLS在含有TNF-α、CGP42112A培養基中繼續培養24 h，記為TNF-α組和AT2R激動劑組，以不做任何處理細胞作為空白組，以轉染siAT2R為siAT2R組。使用MTT進行細胞增殖測定，實驗進行3次生物學重復。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1對照組與OA組AT2R表達 OA組AT2R蛋白表達量(2.11±0.42)較對照組(1.02±0.31)顯著增加(t=3.617，P=0.022)，提示AT2R可能與OA發生有關。見圖2。

1、2、3：對照組；4、5、6：OA組圖2 對照組與OA組AT2R表達

2.2炎癥因子對OA-FLS細胞中AT2R表達及增殖影響 與空白組相比，TNF-α組、IL-1β組及IL-1β+TNF-α組H-FLS細胞及TNF-α組、IL-1β+TNF-α組OA-FLS細胞中AT2R表達均顯著增加(P<0.05)，表明膝骨關節炎炎癥微環境可導致滑膜組織AT2R表達增加。見圖3，表1。

1～4：H-FLS細胞；5～8：OA-FLS細胞；1、5：空白組；2、4：IL-1β組；3、7：TNF-α組；4、8：IL-1β+TNF-α組圖3 炎癥因子TNF-α、IL-1β對H-FLS和OA-FLS中AT2R表達影響

組別H-FLSOA-FLS空白組0.07±0.010.42±0.03IL-1β組0.13±0.011)0.43±0.03TNF-α組0.28±0.021)0.52±0.041)IL-1β+TNF-α組0.39±0.041)0.75±0.081)F值114.68228.816P值0.0000.000

與空白組相比：1)P<0.05

2.3干擾和激活AT2R對OA-FLS中炎癥因子表達影響 siAT2R組AT2R蛋白表達(0.21±0.02)較NC組(0.46±0.04)明顯降低(t=9.683，P=0.001)，見圖4。與NC組相比，siAT2R組IL-6、IL-1β mRNA表達明顯增加(P<0.05)，而AT2R激動劑組IL-6、IL-1β mRNA表達顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4AT2R對OA-FLS細胞中NF-κB 信號通路影響 與對照組相比，TNF-α組、siAT2R組NF-κB p65活性顯著增加(P<0.05)，AT2R激動劑組NF-κB p65活性明顯被抑制(P<0.05)；而將IL-6啟動子上NF-κB p65結合位點突變構建的pIL-6-promoter-luc-Mut載體轉入細胞后，TNF-α、siAT2R、AT2R激動劑各組熒光素酶活性均無明顯變化(P>0.05)。見圖5，表3。結果表明，激活AT2R能夠抑制NF-κB對炎癥因子IL-6誘導作用。

圖4 Western印跡法檢測OA-FLS細胞中轉染siRNA后AT2R蛋白表達

組別IL-6IL-1β空白組1.00±0.031.00±0.02NC組0.98±0.041.02±0.03siAT2R組1.32±0.081)1.35±0.061)AT2R激動劑組0.41±0.041)0.45±0.031)F值163.762287.793P值0.0000.000

與NC組相比：1)P<0.05

圖5 NF-κB在IL-6啟動子區的結合位點

組別pIL-6-promoter-luc-MutpIL-6-promoter-luc-WT對照組1.00±0.121.57±0.18TNF-α組1.12±0.146.12±1.031)siAT2R組1.03±0.094.03±0.941)AT2R激動劑組0.99±0.110.71±0.081)F值0.77536.380P值0.5400.000

與對照組相比：1)P<0.05

2.5激活AT2R對OA-FLS細胞增殖影響 與空白組相比，在48 h、72 h時TNF-α組、siAT2R組OA-FLS細胞增殖能力顯著增強(P<0.05)，而AT2R激動劑組細胞增殖能力被顯著抑制(P<0.05)。見表4。

表4 各組OA-FLS細胞增殖能力比較

與空白組相比：1)P<0.05

3 討 論

OA是常見的關節疾病之一〔9〕，主要表現是關節疼痛和活動不靈活，多發生于老年人群，研究表明，OA與關節局部的炎癥反應密切相關〔10〕。AT2R在多種疾病中起重要作用，如心血管疾病、高血壓、免疫疾病等。苗莉等〔11〕研究發現，AT2R基因可能抑制血管損傷后骨橋蛋白(OPN)的表達及新生內膜的過度增生。寇學俊等〔12〕研究報道，AT2R基因多態性與老年原發性高血壓患者動態血壓參數有關。唐兵等〔13〕研究表明，AT2R能夠抑制樹突細胞成熟誘導的局部免疫炎性反應，推測AT2R可能介導抑制動脈粥樣斑塊的進展。此外，有研究報道AT2R在大鼠佐劑性關節炎滑膜組織中表達，TNF-α或IL-1β促炎性細胞因子刺激牛軟骨細胞中也表達AT2R，而在未刺激的細胞中則無此現象〔14,15〕。有研究也表明AT2R可能介導與AT1R相反的作用，其可能主要發揮抗炎作用〔16～19〕。然而，到目前為止，尚無體外研究AT2R在FLS細胞中的表達和可能功能。本研究發現，與健康患者滑膜組織相比，OA患者滑膜組織中AT2R表達顯著增加。值得注意的是，用TNF-α和IL-1β處理不僅能夠促進OA-FLS中AT2R的表達，而且還能誘導其在H-FLS中表達。本研究表明，促炎性刺激可以誘導和維持FLS中AT2R的表達，這與先前研究結論相一致，在體內AT2R在健康組織中僅微弱表達，而當組織損傷情況下AT2R表達強烈明顯增加〔20〕，提示AT2R與OA進展密切相關。

細胞因子是參與免疫和炎癥反應的細胞所分泌的、能調節細胞功能的小分子蛋白和多肽〔21〕，其廣泛存在于機體各種組織中，它們從分子水平上對多種疾病的發生發展起較為重要的調節作用〔22,23〕。有研究者發現關節功能的喪失與血清及組織中促炎性細胞因子的高濃度有關〔14〕。Pattacini等〔6〕研究表明，血管緊張素Ⅱ能夠通過AT1R依賴的NF-κB通路激活來保護RA-FLS免于凋亡。本研究證實OA-FLS中AT2R表達增加，這進一步促使我們來闡明AT2R在調節這些細胞功能表型的潛在作用。因此，本研究探討了AT2R功能獲得或喪失是否會影響OA-FLS中促炎性細胞因子的基因表達及NF-κB激活，發現在OA-FLS細胞中敲減AT2R明顯促進了IL-6、IL-1β表達，相反AT2R激動劑CGP42112A處理后IL-6、IL-1β表達顯著被抑制，這與先前在糖尿病危害動脈粥樣硬化、早期糖尿病腎炎、內皮炎癥及巨噬細胞中研究結論一致，AT2R可能主要發揮抗炎作用〔16～19〕。用AT2R激動劑治療OA-FLS顯著降低NF-κBp65的DNA結合活性，這與Rompe等〔24〕通過激活AT2R能夠阻斷原代人和小鼠真皮成纖維細胞中NF-κB來降低TNF-α誘導的IL-6水平的研究結論一致。此外，MTT實驗發現敲減AT2R明顯促進了細胞增殖，而AT2R激動劑則明顯抑制了OA-FLS增殖能力。

綜上所述，本研究證明AT2R在膝骨關節炎滑膜組織中高表達；促炎因子可刺激FLS中AT2R 顯著上調；用選擇性激動劑激活AT2R能夠抑制OA-FLS中促炎因子IL-6、IL-1β表達，抑制細胞OA-FLS增殖，闡明了一種膝骨關節炎進展的正反饋機制，提示AT2R激動劑可能代表了一種潛在的緩解OA滑膜炎癥的新型治療策略，但是還需要進一步的轉化研究。