小膠質(zhì)細(xì)胞激活研究中免疫組化和熒光技術(shù)的應(yīng)用

王羽茜， 張思然， 陳 璐，3， 李成檀，鄭 威， 王瓊珠， 趙建波， 王艷芳，張麗慧

(1.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036;2. 浙江醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310013; 3. 常州衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 常州 213002)

腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是中樞神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease， PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)以及腦缺血損傷的共同病理過(guò)程，在腦損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在腦內(nèi)廣泛分布。各種病理刺激可誘導(dǎo)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，炎癥分子表達(dá)和釋放增加與神經(jīng)元變性死亡密切相關(guān)[1-2]。在神經(jīng)炎癥過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能改變以及炎癥分子表達(dá)變化需要基于細(xì)胞分子基礎(chǔ)的直觀研究方法。免疫組化(immunohistochemistry， IHC)和免疫熒光(immunofluorescence， IF)結(jié)合顯微成像分析技術(shù)使神經(jīng)炎癥的可視化研究成為可能，已成為神經(jīng)科學(xué)研究的重要方法[3-5]。本研究應(yīng)用IHC和IF方法結(jié)合顯微成像技術(shù)，監(jiān)測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導(dǎo)的大鼠腦組織及體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活改變，并探討炎癥激活過(guò)程中的LPS濃度依賴性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 兔抗離子鈣接頭蛋白分子1(ionized calcium binding adaptor molecule 1， Iba-1)抗體購(gòu)于日本W(wǎng)ako公司，羊抗Iba-1抗體購(gòu)于英國(guó)abcam公司，兔抗白細(xì)胞介素1beta(interleukin1beta， IL1beta)抗體購(gòu)于英國(guó)abcam公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標(biāo)記的熒光微珠(直徑1μm)購(gòu)于美國(guó)Inventrogen公司，LPS和DAPI購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；BX51熒光生物顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，CCD攝像頭(WV-CP-230)購(gòu)于日本松下公司，石蠟切片機(jī)(RM2235)購(gòu)于德國(guó)Leica公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Forma Scientific公司。

1.2 大鼠腦炎癥模型 健康成年雄性Sprague-Dawleg(SD)大鼠，體重200～250 g，由杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，大鼠稱重分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，12 h明暗循環(huán)，室溫22～25 ℃。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和LPS組，LPS組腹腔注射LPS 2.5 mg/kg；對(duì)照組腹腔注射等容生理鹽水。兩組分別給藥7 d后麻醉處死取腦，常規(guī)固定和處理后制作8 μm腦組織石蠟切片。

1.3 Iba-1免疫組化染色 取腦炎癥模型大鼠腦組織石蠟切片42 ℃烤片2 h，再經(jīng)脫蠟和水化后，枸櫞酸鈉緩沖溶液高溫高壓修復(fù)。TBST洗3次，5 min/次，5% BSA室溫封閉1 h后，加1∶200羊抗 Iba-1一抗(5% BSA稀釋)4℃過(guò)夜。回收一抗后，切片TBST洗3次，5 min/次。3% H2O2覆蓋15 min后，再TBST洗3次，5 min/次。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，TBST洗3次，5 min/次。增強(qiáng)酶標(biāo)兔抗山羊IgG聚合物室溫孵育20 min，TBST洗3次，5 min/次。DAB避光顯色15 min，流水沖洗后擦干，組織脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡拍攝。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)BV2細(xì)胞系細(xì)胞采用含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5 % 二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔1 d換1 次培養(yǎng)液。細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右時(shí)，1∶2傳入至新的培養(yǎng)皿。

1.5 小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能檢測(cè) 將BV2細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板，貼壁生長(zhǎng)24 h后作相應(yīng)藥物處理。每孔加入直徑1 μm熒光微珠0.4 μL，37℃孵箱溫育1 h。室溫下0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次；然后4%多聚甲醛37℃固定15 min，吸棄并晾干；室溫下0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。破膜：室溫下0.1% Triton X-100(0.01mol/L PBS稀釋)孵育10 min；0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次。5%羊血清(PBS稀釋)室溫封閉2 h。回收羊血清，添加兔源Iba-1抗體(1∶2000)，室溫下?lián)u床孵育30 min后濕盒4℃過(guò)夜。0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次，滴加用0.01mol/L PBS稀釋的熒光二抗FITC-抗兔IgG(1∶200)，室溫避光孵育2 h后，0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。熒光顯微鏡下拍攝計(jì)數(shù)，以熒光微球在細(xì)胞膜內(nèi)為陽(yáng)性細(xì)胞，吞噬率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) /細(xì)胞總數(shù))×100%，藥物處理組數(shù)值為相對(duì)于對(duì)照組的百分比。

1.6 IL1beta免疫熒光染色 BV2細(xì)胞接種于無(wú)菌激光共聚焦培養(yǎng)皿中，貼壁生長(zhǎng)24 h后作相應(yīng)藥物處理。室溫下，0.01mol/L PBS清洗3次，5 min/次，4%多聚甲醛37℃固定15 min，吸棄并晾干。室溫下0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。破膜：室溫下0.1% Triton X-100(0.01 mol/L PBS稀釋)孵育10 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次，5%羊血清(PBS稀釋)室溫封閉1h。回收羊血清，添加用抗體稀釋液配制的兔源IL1beta抗體(1∶800)，濕盒4 ℃過(guò)夜。0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次，避光滴加用0.01mol/L PBS稀釋的Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗(1∶1000)，37℃避光孵育2 h，0.01mol/L PBS清洗3次，5min/次。1∶1000 DAPI室溫染色10 min，PBS洗3次，5 min/次。熒光顯微鏡拍攝。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)顯著差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦炎癥模型中小膠質(zhì)細(xì)胞激活 對(duì)照組大鼠大腦皮層有少量Iba-1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較小，細(xì)胞突起成細(xì)長(zhǎng)分支狀。與對(duì)照組比較，2.5 mg/kg LPS組大鼠皮層Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞胞體變大、深染，突觸變短變粗，細(xì)胞形態(tài)多變。見(jiàn)圖1。

A： 對(duì)照組; B～D： 2.5 mg/kg LPS組 (標(biāo)尺=20 μm); E： 小膠質(zhì)細(xì)胞照片拍攝腦區(qū)。圖1 IHC檢測(cè)大鼠腦炎癥模型中皮層小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

2.2 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性 對(duì)照組可見(jiàn)少量BV2細(xì)胞內(nèi)有FITC標(biāo)記的熒光微球。LPS處理后，吞噬熒光微球的BV2細(xì)胞數(shù)量增加，10 ng/mL LPS組和100 ng/mL LPS組BV2細(xì)胞熒光微球吞噬率與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：對(duì)照組；B：1 ng/mL LPS組；C：10 ng/mL LPS組；D：100 ng/mL LPS組；E：小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性統(tǒng)計(jì)分析(n=4)，與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01；標(biāo)尺=20 μm。圖2 IF法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性改變

2.3 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL1beta表達(dá) 采用IL1beta抗體IF染色結(jié)果顯示，對(duì)照組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Alexa Fluor 555標(biāo)記的IL1beta蛋白呈現(xiàn)微弱的紅色熒光，100 ng/mL LPS處理后，BV2細(xì)胞Alexa Fluor 555標(biāo)記的IL1beta蛋白紅色熒光增強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

A～C： 對(duì)照組; D～F： 100 ng/mL LPS組; 標(biāo)尺=20 μm。圖3 IF染色顯示BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL1 beta表達(dá)變化

3 討論

腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活是導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡的關(guān)鍵因素。LPS是經(jīng)典的小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑，常用于制作腦損傷炎癥動(dòng)物和細(xì)胞模型[5-9]。研究表明[5-6]，LPS可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及增加神經(jīng)毒性的炎癥介質(zhì)合成和釋放。腦內(nèi)或全身給予LPS，可誘導(dǎo)大鼠和小鼠的黑質(zhì)和海馬等腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，并進(jìn)一步介導(dǎo)神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能障礙[7-9]。在本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，以1.25～10 mg/kg LPS連續(xù)腹腔注射， 1.25 mg/kg LPS未能誘導(dǎo)明顯的腦內(nèi)炎癥，而5 mg/kg LPS和10 mg/kg LPS處理后，大鼠死亡率增加，故本研究選用2.5 mg/kg LPS作為制作大鼠腦內(nèi)炎癥的合適劑量。

Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物，在靜息或激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[10]。本研究應(yīng)用抗Iba-1抗體IHC染色結(jié)果表明，生理鹽水對(duì)照組大鼠皮層Iba-1蛋白呈弱表達(dá)，只見(jiàn)少量靜息小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體小有細(xì)長(zhǎng)突起。LPS處理組大鼠皮層Iba-1蛋白表達(dá)增高，Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)增殖與形態(tài)改變，細(xì)胞體變大、深染，突起變粗變短，表明小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性激活，提示應(yīng)用LPS成功建立了大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型，為今后課題組開(kāi)展動(dòng)物水平抗小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥藥物研究奠定了基礎(chǔ)。

吞噬活性是神經(jīng)炎癥研究中評(píng)價(jià)小膠質(zhì)激活的另一重要指標(biāo)。體內(nèi)外系列研究表明[11-13]，過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬是腦缺血后神經(jīng)元遲發(fā)性死亡和缺失的重要原因；抑制腦缺血、魚藤酮和LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬可減輕神經(jīng)元死亡和神經(jīng)損傷，提示病理?xiàng)l件下異常的細(xì)胞吞噬在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥及神經(jīng)元死亡中的作用。小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞具有高度純化、能穩(wěn)定傳代并保持原代小膠質(zhì)細(xì)胞的特性，常用于小膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)研究[5，14]。本研究首先應(yīng)用IF方法結(jié)合顯微攝像技術(shù)觀察LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞吞噬FITC-標(biāo)記熒光微球活性改變，結(jié)果顯示，LPS可促進(jìn)BV2細(xì)胞熒光微球吞噬率增加，且呈濃度依賴性。本研究進(jìn)一步以流式細(xì)胞法檢測(cè)同樣處理的BV2細(xì)胞的吞噬功能[5]，結(jié)果顯示，流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果與IF法結(jié)果一致，提示IF法作為一個(gè)簡(jiǎn)便有效直觀的檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬方法，可用于細(xì)胞吞噬活性研究的初篩。

IL1beta是激活小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放的重要炎癥細(xì)胞因子，在AD、PD和腦缺血等腦損傷中具有重要作用[15]。課題組應(yīng)用PD體外模型，ELISA方法檢測(cè)結(jié)果表明[5，14]，魚藤酮和LPS處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥細(xì)胞因子IL1beta和IL6濃度增加；以魚藤酮和LPS處理的BV2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)PC12細(xì)胞可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)毒性；5-脂氧酶抑制劑和半胱氨酰白三烯受體拮抗劑可抑制魚藤酮和LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)物，可減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。本研究進(jìn)一步以IF染色方法直觀地證實(shí)LPS可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL1beta的表達(dá)。

綜上所述，系統(tǒng)應(yīng)用IHC和IF技術(shù)并結(jié)合其他細(xì)胞和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，如PCR、Western blot、ELISA以及流式細(xì)胞術(shù)，可以多視角多方位地闡述神經(jīng)炎癥改變，對(duì)揭示小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥相關(guān)的中樞退行性疾病和腦缺血的病理生理機(jī)制以及尋找潛在的治療藥物具有理論和實(shí)際意義。